核酸检测的自我鉴定9篇核酸检测的自我鉴定 核酸的分离纯化和鉴定 核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而存在。分离纯化核酸总的原则:1、保证一级结构的完整性，完整的下面是小编为大家整理的核酸检测的自我鉴定9篇,供大家参考。
核酸包括DNA、 RNA， 在细胞中都与蛋白质结合而存在。 分离纯化核酸总的原则 :1 、 保证一级结构的完整性， 完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础；减少化学、 物理、 生物因素对核酸的降解：避免过酸、 过碱对磷酸二酯键的破坏；避免机械剪切力以及高温煮沸；抑制DNase或RNase的活性；2、 排除蛋白质、 脂类、 糖类等分子的污染。
真核DNA提取的主要步骤真核生物的一切有核细胞（ 包括培养细胞）
都可以用 来制备基因组DNA。 温和裂解细胞， 溶解DNA， 使DNA与组蛋白分离； 采用 化学或酶学方法去除蛋白质、 RNA及其他大分子。
外周血白细胞DNA的提取（ NaI法）原理利用 双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜， 释放出血红蛋白及细胞核， NaI破核膜并有效解离DNA-蛋白质复合物， 使核酸处于易提取状态，再以氯仿/异戊醇抽提（ 蛋白质变性沉淀并溶解脂类， 异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生）
， 离心后DNA存在于上层水相中， 以37%异丙醇沉淀及洗涤DNA， 即获得白细胞DNA。
用 此法提取的DNA可用 于Southern 杂交、 PCR的模板等。
【试剂】1． 6 mol/L NaI 2． 氯仿/异戊醇(24: 1 V/V) 混合液， 应在棕色密封瓶中保存。3． 异丙醇（ isopropanol）
(A. R)4． 37% 异丙醇或70%乙醇5． 双蒸水(ddH2O)
(高压灭菌)6． TE缓冲液 (pH 8. 0)
(10 mmol/L Tris-Cl、 1 mmol/L EDTA)
高压灭菌。
操作步骤1.取新鲜抗凝血100μ l置Ep管中,
离心10000rpm× 1 min。2.弃上清， 加ddH2O 200μ l,
摇匀20s。3.加6mol/L NaI 200μ l,
缓慢倒置摇匀 20s。4.于管内 加氯仿/异戊醇(24: 1) 400μ l,
缓慢颠倒混匀两相， 离心10 000rpm× 10min。5.吸取上层水相350μ l置一新Ep管中， 加纯异丙醇200μ l,
混匀 。6.室温放置15min,
离心14 000rpm× 12min。
Water phase (DNA)Water phase(DNA)proteins
precipitatechloroform /isoamyl alcohol (lipids)STEP 5
7.小心弃去上清， 再加37%异丙醇（ 或70%乙醇）
1 ml(勿摇动) ， 离心14000rpm× 12min.8.小心弃异丙醇（ 或乙醇）
， 于室温敞口 放置直至可见的痕量液体挥发殆尽。9.加50μ l TE缓冲液溶解DNA,
以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。
1.标本必须新鲜， 提取前细胞应保持完整。
所用 Ep管、 滴头等用 品及ddH2O、 试剂等应高压灭菌， 操作尽量在4℃以下进行。2.混匀试剂、 吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。3.弃去异丙醇时动作应轻， 切忌甩干， 以免DNA丟失。4.0. 54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、 tRNA及多 糖不产生沉淀。
一般不需在低温条件下长时间放置。
其缺点是易使盐类与DNA共沉淀； 在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去， 所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。5.室温下放置16h或65℃放置1h,
可加快基因组DNA沉淀的溶解。【注意事项】
核酸的鉴定与分析 紫外分光光度法可用 于确定核酸的浓度及纯度。 核酸的分级分离。
层析技术及凝胶电泳法， 凝胶电泳分离法分制备型和分析型， 根据分离核酸片 段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 核酸杂交技术用 于鉴别某个特定的片 段。 多 聚酶链反应（ polymerase chain reaction,
PCR）对目 的基因进行DNA序列分析及鉴定 。 DNA测序 基因表达分析（ RNA详细结构和数量的分析）
DNA的鉴定一、 紫外法测DNA的纯度及浓度原理：组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性， 最大吸收峰在260nm， 这是紫外测定核酸的基础。
蛋白质在280nm处有最大的吸收峰， 盐和小分子则集中在230nm处。
OD值为1时相当于大约50μ g/ml双链DNA 。
通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。
紫外法仅用 于测定浓度大于0. 25μ g/ml的核酸溶液。
操作取15μ l DNA样品于3ml双蒸水中， 分别于260、 280、 230nm处比色并记录。定量分析：DNA＝ A260× 核酸稀释倍数(3000/15) × 50/1000=10× A260(ug/ul)纯度分析：DNA
A260/A280=1. 8A260/A280>1. 8， 有RNA杂质， 用 RNase消化；A260/A280<1. 7, 有杂蛋白， 重复抽提纯化步骤;A260/A230<2. 0， 可能有盐未除尽。注：
此法不能区分DNA和RNA， 不能用 于核酸粗制品的测定。
核酸凝胶电泳 核酸是带均匀负 电荷的分子， 在电场中向正极移动， 不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同， 在自 由泳动时， 各核酸分子的迁移率区别很小， 难以分开。
以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质， 具有分子筛效应， 使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异， 达到分离的目 的， 此为分离、 鉴定和纯化核酸片 段的标准方法。
DNA的琼脂糖凝胶电泳原理 DNA分子带负 电荷， 在电场中受到电荷效应、 分子筛效应向正极移动过程中,
因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异， 对于线形DNA分子， 其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。
电泳时加溴化乙锭（ EB）
， 其与DNA结合形成一种荧光络合物， 在254－ 365nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光， 可用 于检测DNA。
【试剂与材料】1． 5× TBE缓冲液(pH 8. 3) ：
54 g Tris碱,
27. 5 g硼酸,
20 ml 0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0) ,
加水至1 L。2． 0. 5× TBE缓冲液 (pH 8. 3)3． 溴化乙锭(EB) ：5 mg/ml4． 1－ 2% 琼脂糖凝胶:
琼脂糖1－ 2 g加至100 ml 0. 5× TBE缓冲液,
加热熔解备用 。5． 6× 凝胶上样缓冲液：
0. 25%溴酚蓝， 0. 25%二甲苯青FF， 30%甘油溶于水中， 4℃保存。6． DNA分子量标准
【操作步骤】1． 琼脂糖凝胶板的制备：
将1%－ 2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀， 冷却到65℃加EB至终浓度0. 5μ g/ml， 倒入凝胶槽， 厚度约3－ 5mm， 放置样品梳， 待冷却成形后取出梳子及隔板， 放入水平电泳槽中， 缓冲液淹没过胶1－ 2mm为止。2． 加样：
样品中加1/5体积的6× 凝胶上样缓冲液， 混匀， 取15μ l加入凝胶点样孔中。
同时要设立合适的DNA分子量标准物。3． 电泳：
电压2－ 10V/cm 胶,
待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时， 关闭电源。4． 取出凝胶块， 置紫外透射反射分析仪上观察， 即可见桔红色的DNA区带。
【注意事项】1． 加样时勿破坏样品孔， 否则DNA带型不整齐。2． 上样缓冲液中适量的甘油， 蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度， 使样品均匀沉到样孔底， 而溴酚蓝、 二甲苯青可使样品带色， 便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。3． EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性， 应戴手套操作， 对于含有EB的溶液用 后应妥善净化处理。4． 电泳过程中， EB向阴极移动， 延长电泳时间， EB会从凝胶中迁移出来， 从而使小片 段DNA难于检测， 可将凝胶浸在0. 5 μ g/ml EB溶液中重新染色后检测。5． 加样孔的加样量依DNA样品中片 段的数量及大小而定， 通常对0. 5cm宽的加样孔， DNA上样量在0. 1－ 0. 5μ g即可有良好的观察效果。6． 小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快， 常用 于快速分析。
小胶通常要在高电压下电泳(＞ 10 V/cm) 。
应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。
思考题1、 分离核酸的基本原则包括哪两方面？2、 试比较用 EB进行DNA凝胶电泳前（ 加在上样缓冲液中）
、 电泳中（ 加在凝胶中）
、 电泳后（ 凝胶浸泡于EB溶液中）
的染色过程， 各有何有优缺点？
[ 目的]1.熟悉苯酚法提取动物组织中核酸的原理和操作方法；2.了解核酸的组成，掌握核酸组分的鉴定方法。1.熟悉苯酚法提取动物组织中核酸的原理和操作方法；2.了解核酸的组成，掌握核酸组分的鉴定方法。[ 原理]蒸馏水研磨：破坏肝细胞水饱和苯酚：使蛋白质变性，与水分层，核酸位于水相乙醇：沉淀核酸。蒸馏水研磨：破坏肝细胞水饱和苯酚：使蛋白质变性，与水分层，核酸位于水相乙醇：沉淀核酸。
[ 原理]核酸可被硫酸水解得到磷酸、戊糖、含氮碱基化合物，根据这三种物质的性质特点可用不同的方法加以鉴定：核酸可被硫酸水解得到磷酸、戊糖、含氮碱基化合物，根据这三种物质的性质特点可用不同的方法加以鉴定：1 ．磷酸 ：可与钼酸试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀。PO 4 3- +12MoO 3 2- +3NH 4 + +24H + = （NH 4 ）
3 PO 4 •12MoO 3 •6H 2 O↓+6H 2 O2 ．嘌呤：嘌呤碱可与硝酸银作用生成白色的絮状嘌呤银沉淀。：嘌呤碱可与硝酸银作用生成白色的絮状嘌呤银沉淀。3 ．核糖 ：与浓硫酸共热得到糠醛，后者与3 ，5-二羟甲苯缩合而成绿色化合物。二羟甲苯缩合而成绿色化合物。
[步骤]1 ．核酸的提取：①取兔肝1 克，剪碎置于研钵中，加2ml蒸馏水研匀，再加蒸馏水研匀，再加2ml蒸馏水混匀。②取蒸馏水混匀。②取15 ×100mm 短试管1 支，滴加匀浆液40 滴（约2ml）。③向试管中加入）。③向试管中加入90 ％苯酚溶液2ml ，充分振摇5min（注意手法，防止溶液溅出），（注意手法，防止溶液溅出），3000rpm 离心5min。④用滴管小心吸取上层水相至另一试管中（贴壁吸取，为避免吸到下层液，可留一些上层液在原试管内）。⑤加入。④用滴管小心吸取上层水相至另一试管中（贴壁吸取，为避免吸到下层液，可留一些上层液在原试管内）。⑤加入3 ml 95%乙醇，充分摇匀，直至絮状沉淀析出。⑥乙醇，充分摇匀，直至絮状沉淀析出。⑥ 3000rpm 离心5min ，弃去液体，沉淀部分即为核酸。
2 ．核酸的水解：向核酸沉淀中加2ml蒸馏水，震荡摇匀使沉淀溶解。加入蒸馏水，震荡摇匀使沉淀溶解。加入10 ％硫酸2ml ，摇匀，于沸水浴中加热7 分钟，冷却后备用。3 ．核酸的鉴定：①磷酸的鉴定：测定管 对照管核酸水解液 10 -5%硫酸 - 10钼酸试剂 10
10摇匀,沸水浴5min核酸水解液 10 -5%硫酸 - 10钼酸试剂 10
10摇匀,沸水浴5min试剂（滴）管别试剂（滴）管别
②嘌呤的鉴定：测定管 对照管核酸水解液 20 -5%硫酸 - 205％AgNO核酸水解液 20 -5%硫酸 - 205％AgNO 3 3 10 10浓氨水 5 5不可震摇！静置数分钟，观察结果。10 10浓氨水 5 5不可震摇！静置数分钟，观察结果。试剂（滴）管别试剂（滴）管别测定管 对照管核酸水解液 5 -5%硫酸 - 53，5-二羟甲苯 5
5摇匀，沸水浴10min核酸水解液 5 -5%硫酸 - 53，5-二羟甲苯 5
5摇匀，沸水浴10min试剂（滴）管别试剂（滴）管别③核糖的鉴定：
[ 注意] 苯酚、钼酸试剂及3 ，5-二羟甲苯等均有强烈的腐蚀性，操作时务必小心！若接触到苯酚，立即用二羟甲苯等均有强烈的腐蚀性，操作时务必小心！若接触到苯酚，立即用95％酒精清洗。％酒精清洗。实验中用到的第一支试管（含苯酚），不要清洗，请直接放在走廊的红色小桶内。实验中用到的第一支试管（含苯酚），不要清洗，请直接放在走廊的红色小桶内。 提取核酸时，应选用短粗试管（15 ×100mm）；鉴定时则可以选用长试管（）；鉴定时则可以选用长试管（15 ×150mm ）。
ＣＮＫＩ ：
６１ － １３９０ ／ Ｓ．２０１１１０２５．２１３０．０２８ 网络出版时间：
２０１１ － １０ － ２５ ２１ ：
３０网络出版地址：ｈｔｔｐ ：／／ ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ ｋｃｍｓ ／ ｄｅｔａｉｌ ／ ６１．１３９０．Ｓ．２０１１１０２５．２１３０．０２８．ｈｔｍｌ切刻核酸内切酶ＰＮＥ４５的原核表达与活性鉴定＊梁亚峰 １，张 超１ ，王亚楠 １ ，范三红 １ ， ２（ １ 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 ７１２１００ ； ２ 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 ７１２１００ ）［摘 要］ 【目的】对大肠杆菌噬菌体 ｐｈｉＶ１０第４５个基因编码蛋白 ＰＮＥ４５进行原核表达，并检测其酶活性。【方法】设计并合成１０段密码子优化的寡核苷酸序列，采用重叠延伸 ＰＣＲ 技术，将其拼接克隆，获得人工合成的ＰＮＥ ４５基因，然后将其整合入含有 ＭＢＰ纯化标签的 ｐＥＴ２１ａ原核表达载体中，构建重组载体 ｐＥＴ２１ａ － ＭＢＰ － ＰＮＥ ４５ ，诱导表达后获得融合蛋白 ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ 。利用 Ａｍｙｌｏｓｅ亲和层析纯化融合蛋白 ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ ，以 ｐＵＣ１９为底物，分别在 Ｍｇ２＋和 Ｍｎ２＋ 参与下对 ＭＢＰ－ ＰＮＥ４５活性进行初步鉴定。【结果】融合蛋白 ＭＢＰ － ＰＮＥ４５主要以可溶性形式表达，其表达量占细胞总蛋白的３５％左右。
ＰＮＥ４５融合蛋白在 Ｍｇ２＋ 缓冲液中具有 ＤＮＡ随机切刻活性，在 Ｍｎ ２＋ 存在时还具有切刻位点对位切刻活性。【结论】首次成功表达并制备了 ＰＮＥ４５ ，并初步证明其是一种新的随机性切刻核酸酶。［关键词］ ＰＮＥ４５ ；重叠延伸 ＰＣＲ ；表达纯化； ＤＮＡ 切刻核酸酶［中图分类号］ Ｑ５５６＋ ．１［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７１ － ９３８７ （ ２０１１ ）
１２ － ０１９６ － ０５Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＰＮＥ４５ＬＩＡＮＧ Ｙａ － ｆｅｎｇ１ ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｏ１ ，ＷＡＮＧ Ｙａ － ｎａｎ１ ，ＦＡＮ Ｓａｎ － ｈｏｎｇ１ ， ２（１ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ ， Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００ ， Ｃｈｉｎａ ；２ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｔｒｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｒｉｄ Ａｒｅａｓ ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ ， Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００ ， Ｃｈｉｎａ ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：【 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ 】
Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ， ｗｅ ａｔｔｅｍｐｔｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＮＥ４５ ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｅｎｃｏ －ｄｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ４５ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｐｈａｇｅ ｐｈｉＶ１０ ， ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． 【 Ｍｅｔｈｏｄ 】
Ｕｓｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐ －ｐｉｎｇ ＰＣＲ ，１０ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｓｐｌｉｃｅｄ ｔｏ ｇｅｔ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＰＮＥ４５ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｐＥＴ２１ａ －ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ｗｅｒｅ ｐｕｒｉ －ｆｉｅｄ ｂｙ Ａｍｙｌｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ， ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ｐＵＣ１９ａｓ ｓｕｂ－ｓｔｒａｔｅ ｉｎ Ｍｇ２＋ ａｎｄ Ｍｎ ２＋ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．【 Ｒｅｓｕｌｔ 】
ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ｗａｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏ －ｔｅｉｎ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ａｂｏｕｔ ３５％．ＰＮＥ４５ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ＤＮＡ ｎｉｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｇ２＋ｂｕｆｆｅｒ ， ｗｈｉｌｅ ａｌｓｏ ｃｏｕｎｔ －ｅｒ ｎｉｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｎ２＋ｂｕｆｆｅｒ． 【 Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ 】
Ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｒａｎｄｏｍ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＰＮＥ４５ｗａｓ ｅｘ －ｐｒｅｓｓｅｄ ， ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ：
ＰＮＥ４５ ； ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ； ＤＮＡ ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ 根据 Ｒｏｂｅｒｔｓ等２００３年公布的核酸酶命名法则 ［１ － ２ ］ ，切 刻 核 酸 内 切 酶 （Ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，ＮＥａｓｅｓ ）是只切断双链 ＤＮＡ 中一条链的核酸酶，主要包括２类：一类是指与５ － 甲基胞嘧啶（ ｍ５ － ｃｙｔｏ －ｓｉｎｅ ）
ＤＮＡ 甲基转移酶（ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ，ＭＴａｓｅ ）协同作用的内切酶，它们在 ＭＴａｓｅ 识别的＊［收稿日期］ ２０１１ － ０５ － １０［基金项目］ 中央高校基本科研业务专项（ ＱＮ２００９０７０ ）［作者简介］ 梁亚峰（ １９８５－ ），男，山西平遥人，在读硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究。
Ｅ － ｍａｉｌ ：
ｌｉａｎｇｙａｆｅｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ［通信作者］ 范三红（ １９７１－ ），男，陕西合阳人，副教授，硕士生导师，主要从事生物化学与分子生物学研究。Ｅ － ｍａｉｌ ：
ｓａｎｈｏｎｇ．ｆａｎ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
ｍ５ － ｃｙｔｏｓｉｎｅ脱氨基序列的非配对 Ｇ － Ｔ 碱基对附近将一条链切断；另一类切刻酶与限制性内切酶类似，识别双链 ＤＮＡ 中特定的短序列，切刻位点相对灵活，这种内切酶多数与异源二聚体限制性内切酶的亚基同源 ［３ － ４ ］ 。虽然现在已经发现具有专一性的 Ⅱ 型限制性内切酶（ ＲＥａｓｅｓ ）有２４０多种，但是具有商业用途的位点专一性 ＮＥａｓｅｓ只有少数几种，且多是现有 ＲＥａｓ －ｅｓ的基因工程衍生物 ［５ ］ 。因此，通过基因工程改造现有的 ＲＥａｓｅｓ或从细菌、病毒中筛选新酶，努力开发更多的 ＮＥａｓｅｓ非常必要。
ＮＥａｓｅｓ不仅可用于基因工程实验，同时也可用于该类核酸酶的功能和进化研究。目前发现的切刻酶均是位点专一性核酸酶，所以探寻更多的具有随机切刻活性的 ＮＥａｓｅｓ ，对基因工程和该类酶的进化研究具有重要意义。ＰＮＥ４５是大肠杆菌 Ｏ１５７∶Ｈ７噬菌体 ｐｈｉＶ１０第 ４５ 个 基 因 编 码 的 一 个 酶，属 功 能 未 知 的ＤＵＦ１０４６蛋白家族的一员，而且具有典型的 ＰＤ －（ Ｄ ／ Ｅ ）
ＸＫ特征基序 ［６ ］ ，笔者推测其可能是一个核酸内切酶。
ＰＤ － （Ｄ ／ Ｅ ）
ＸＫ 蛋白超家族包括限制性内切酶和许多参与基因重组和修复的核酸酶 ［７ ］ 。所有ＰＤ － （ Ｅ ／ Ｄ ）
ＸＫ 蛋白超家族成员具有相同的核心结构，即由 ２ 段 α － ｈｅｌｉｃｅｓ 将 ４ 股 β － ｓｈｅｅｔｓ 相夹组成的结构，它可以作为弱保守活性中心的支架结构，通常包括２个或３个酸性氨基酸残基（ Ａｓｐ或 Ｇｌｕ ）和１个 Ｌｙｓ 残 基，它 们 共 同 构 成 了 标 志 性 的 催 化 基序 ［８ － １０ ］ 。本研究拟表达纯化大肠杆菌噬菌体ｐｈｉＶ１０中推测的核酸酶 ＰＮＥ４５ ，并对其催化特性进行鉴定，以阐明 ＤＵＦ１０４６蛋白家族功能，为 ＰＤ － （ Ｄ ／ Ｅ ）
ＸＫ蛋白超家族的结构和功能进化研究奠定基础，同时为基因工程研究提供更多的具有新的特殊活性的核酸酶。１ 材料与方法１．１ 材 料大肠杆菌克隆菌株 Ｔｕｒｂｏ 、表达菌株 ＥＲ２５６６ 、质粒 ｐＥＴ２１ａ － ＭＢＰ和 ｐＵＣ１９ ，均由西北农林科技大学生命科学学院保存；质粒 ＤＮＡ 小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒，购自 Ａｘｙｇｅｎ 公司；快速连接酶Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ 、聚合酶 Ｖｅｎｔ （ ｅｘｏ － ）
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ －ａｓｅ 、 ５×Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘｓ ，购自 ＮＥＢ公司；限制性内切酶 Ｈｉｎ ｄ Ⅲ 、 Ｅｃｏ Ｒ Ⅰ ，购自 ＭＢＩ公司；直链淀粉（ Ａｍｙｌｏｓｅ ）亲和层析试剂盒，购自 ＮＥＢ 公司；蛋白质定量试剂，购自Ｂｉｏ － Ｒａｄ公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。１．２ 方 法１．２．１ ＰＮＥ ４５基因的扩增与重组质粒ｐＭ－ ＰＮＥ４５的构建 以 ＧｅｎＢａｎｋ 中 ＰＮＥ ４５ 基因序列 （ Ｇｅｎ －Ｂａｎｋ 号：
３９５３００１ ）为依据，设计 ｐ１～ｐ１０ 共 １０ 条寡核苷酸片段（表 １ ，由华大基因公司合成），首尾 ２ 个片段ｐ１、ｐ１０分别含 ＥｃｏＲⅠ 和 Ｈｉｎ ｄ Ⅲ酶切位点，片段之间两两部分互补。每个片段在原基因中的位置如图１所示。所有的寡核苷酸序列均经过密码子优化和退火温度平均化处理，其退火温度均在６０℃左右。各片段的核苷酸序列见表１ 。表 １ 用于 ＰＮＥ ４５ 基因合成的寡核苷酸序列Ｔａｂｌｅ １ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｉｃｔｉｄｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ＰＮＥ ４５ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ序列编号Ｓｅｑｕｎｃｅ Ｎｏ．序列（ ５′→３′ ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｐ１ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＧｐ２ＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＴＴＴＴＣＡＧＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴｐ３ＴＧＡＡＴＡＡＡＡＣＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＣＡＡＡＣＧＴＧＣＣＧＧＴＧｐ４ＣＧＣＡＧＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＡＡＡＣＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＧＴＴＴＧｐ５ＡＡＧＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＣＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣｐ６ＣＴＴＣＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣＧＴｐ７ＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧＴＣＡＡＡＡＣｐ８ＧＡＴＡＡＴＡＣＧＧＡＡＣＧＧＧＴＡＣＴＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧＧＧＣＡＴｐ９ＣＡＧＴＡＣＣＣＧＴＴＣＣＧＴＡＴＴＡＴＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＴＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴｐ１０ＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣ 注：ｐ１、ｐ１０ 中下划线碱基分别为 ＥｃｏＲⅠ 和 Ｈｉｎ ｄⅢ酶切位点。Ｎｏｔｅ ：
Ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｂａｓｅｓ ｉｎ ｐ１ ， ｐ１０ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ Ｅｃｏ ＲⅠａｎｄ Ｈｉｎ ｄⅢｃｕｔｔｉｎｇ ｓｉｔｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． 利用重叠 ＰＣＲ 技术，通过 ２ 轮 ＰＣＲ ，扩增获得ＰＮＥ ４５基 因 片 段。第 １ 轮 ＰＣＲ 体 系 为 ５０ μ Ｌ ：ｐ２～ｐ９ （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ）各１μ Ｌ ，ｐ１和ｐ１０ （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）各 １０μ Ｌ ， ５×反 应 Ｂｕｆｆｅｒ １０μ Ｌ ， ｄＮＴＰ （１０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）
２ μ Ｌ ，聚合酶 Ｖｅｎｔ （ ２ ０００Ｕ ／ ｍＬ ）
１ μ Ｌ，补加双蒸水至 ５０ μ Ｌ 。反应程序为：
９４ ℃ 预变性 ３７ ９ １第１２期 梁亚峰，等：切刻核酸内切酶ＰＮＥ４５的原核表达与活性鉴定
ｍｉｎ ； ９４℃变性３０ｓ ， ５５ ℃退火３０ｓ ， ７２ ℃延伸３０ｓ ， ３０个循环； ７２℃延伸５ｍｉｎ 。第２轮ＰＣＲ体系为５０ μ Ｌ ：ｐ１和ｐ１０ （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ）各１μ Ｌ ，第１轮 ＰＣＲ产物 １０ μ Ｌ ， ５× 反 应 Ｂｕｆｆｅｒ １０ μＬ ， ｄＮＴＰ （ １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）
２ μ Ｌ ，聚合酶 Ｖｅｎｔ （ ２ ０００Ｕ ／ ｍＬ ）
１ μ Ｌ ，补加双蒸水至５０ μ Ｌ 。反应程序同第１轮 ＰＣＲ 。取第２轮ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，经 Ｈｉｎ ｄⅢ 和 Ｅｃｏ ＲⅠ 双酶切后，利用 ＱｕｉｃｋＬｉｇａｓｅ 连接到 ｐＥＴ２１ａ － ＭＢＰ 载体，构建重组质粒ｐＥＴ２１ａ － ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ （ｐＭ－ ＰＮＥ４５ ），对其进行ＰＣＲ扩增与 Ｈｉｎ ｄⅢ 和 Ｅｃｏ ＲⅠ 双酶切电泳检测，并送华大基因公司进行测序鉴定。图１ ＰＮＥ ４５基因的拼接示意图Ｆｉｇ．１ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｆｏｒ ＰＮＥ ４５ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ１．２．２ 重组蛋白 ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ 的表达与纯化 将重组质粒ｐＭ－ ＰＮＥ４５ 转化表达菌 ＥＲ２５６６ 感受态细胞，氨苄青霉素（１００ μ ｇ ／ ｍＬ ）抗性筛选阳性克隆。挑取阳性克隆，接入含氨苄青霉素（１００ μ ｇ ／ ｍＬ）的 ＬＢ培养基，３７℃ 条件下摇菌过夜，按 １∶１００ 体积比转接到２００ｍＬ ＬＢ培养基中，摇菌到 ＯＤ ６００ 约为０．５ ，加入ＩＰＴＧ至其终浓度为０．５ｍｍｏｌ／ Ｌ ，２８℃诱导８ｈ 。取诱导培养物，１２ ０００ｒ ／ ｍｉｎ离心５ｍｉｎ ，收集菌体，加入２０ｍＬ平衡缓冲液（１０ｍｍｏｌ／ Ｌ Ｔｒｉｓ － ＨＣｌ ，５０ｍｍｏｌ／ ＬＮａＣｌ ， ｐＨ ７．２ ）重新悬浮菌体，超声破碎（功率４００Ｗ ，超声２ｓ ，停２ｓ ，冰浴）直至菌体完全破碎，４ ℃下１２ ０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０ｍｉｎ 回收上清液，利用 Ａｍｙｌｏｓｅ亲和层析纯化目标蛋白，１２％ ＳＤＳ － ＰＡＧＥ 电泳检测纯化效果。用 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ 凝胶定量软件扫描电泳结果，分析目标蛋白占总蛋白的百分比。纯化的蛋白用 Ｂｉｏ － Ｒａｄ 蛋白质定量试剂检测浓度，然后加入甘油至其体积分数达 ５０％ ， －２０℃ 条件下保存。１．２．３ ＰＮＥ４５的酶活性鉴定 酶活性检测原理是基于切刻核酸内切酶可以在超螺旋的质粒上随机或者专一性地将其中一条链切断，从而使超螺旋解旋，变为环状，但是当切口靠得太近时会将 ＤＮＡ 切为线性，琼脂糖凝胶电泳检测时会出现３条带，从前到后依次为超螺旋条带、线性条带、切刻环状质粒条带。如果内切酶具有切刻位点对位切刻活性，则会将质粒进一步降解为更小的片段。许多试验表明，内切酶都依赖金属离子 Ｍｇ２＋ ，Ｍｎ２＋ 也可能作为辅基存在 ［１１ ］ ，故本试验分别在 Ｍｇ ２＋或 Ｍｎ２＋ 的参与下进行酶切反应，以比较ＰＮＥ４５在２种条件下切刻活性的差异。取１ μ ｇ ｐＵＣ１９质粒作为底物，分别与不同质 量 浓 度 （ ２．５ ， １．２５ ，０．６２５ ， ０．３１３ ， ０．１５６ ，０．０７８ ， ０．０３９ ， ０．０２０ ， ０．０１０ μ ｇ ／ ｍＬ ）的 ＰＮＥ４５酶在Ｍｇ２＋ 参与下进行酶切反应，反应体系为 ２０ μＬ ：
２０ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ － ＨＣｌ ｐＨ ７．６ ， ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ ， ２ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＤＴＴ ， ５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ ２ ，体积分数 ０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ － Ｘ １００ ；反应条件为 ３７℃ 温浴 １ｈ ，试验同时设立不做酶处理的对照。取酶切产物，用 １０ｇ ／ Ｌ 琼脂糖凝胶进行电泳（１００Ｖ ， ４５ｍｉｎ ），检测ＰＮＥ４５的随机切刻活性和切刻位点对位切刻活性。
Ｍｎ２＋参与下的酶切反应体系与条件同上，只是将体系中５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ ２ 换为５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｎＣｌ ２ ，酶质量浓度分别为１．２５ ， ０．６２５ ， ０．３１３ ， ０．１５６和０．０７８ μ ｇ／ ｍＬ 。２ 结果与分析２．１ ＰＮＥ ４５基因的扩增与重组质粒ｐＭ－ ＰＮＥ４５的鉴定从图 ２ 可以看出，第 １ 轮 ＰＣＲ 产物电泳检测不到特异的条带，第 ２ 轮 ＰＣＲ 产物检测到了 ３４５ｂｐ左右的 ＤＮＡ 片段，与目的基因长度一致。重组质粒ｐＭ－ ＰＮＥ４５ 的双酶切鉴定结果（图 ３ ）显示，酶切获得了 ３４５ｂｐ 的条带，与预期结果一致。酶切鉴定后的质粒送华大基因公司进行测序鉴定，结果与设计序列一致。图２ ＰＮＥ４５基因的ＰＣＲ扩增Ｍ．２ －ｌｏｇ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ； １． 第 １ 轮 ＰＣＲ 产物； ２． 第 ２ 轮 ＰＣＲ 产物Ｆｉｇ．２ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ＰＮＥ４５Ｍ．２ －ｌｏｇ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ； １．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ ；２．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ８ ９ １西北农林科技大学学报（自然科学版）
第３９卷
２．２ ＰＮＥ４５蛋白的表达与纯化ＳＤＳ － ＰＡＧＥ电泳检测结果（图４ ）表明，表达纯化后获得了５６ｋｕ融合蛋白 ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ ，其分子质量大小与设计结果一致，表明该蛋白在细胞中主要以可溶性形式表达。
Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ凝胶定量软件分析结果显示，融合蛋白占总蛋白的３５％左右。对纯化的目标蛋白使用Ｂｉｏ － Ｒａｄ蛋白质定量试剂检测其质量浓度，结果显示，蛋白质质量浓度约为０．５６８ｍｇ／ ｍＬ ，总共纯化到约０．８ｍｇ 的目标蛋白。图 ３ 重组质粒ｐＭ－ ＰＮＥ４５ 的双酶切鉴定Ｍ．２ －ｌｏｇ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ； １． Ｅｃｏ ＲⅠ 和 Ｈｉｎ ｄⅢ双酶切的重组质粒 ｐＭ － ＰＮＥ４５Ｆｉｇ．３ Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭ － ＰＥＮ４５Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ ２ －ｌｏｇ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ；１．ｐＭ － ＰＥＮ４５ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｅｃｏ ＲⅠａｎｄ Ｈｉｎ ｄⅢ图 ４ 纯化重组蛋白 ＭＢＰ － ＰＮＥ４５ 的 ＳＤＳ － ＰＡＧＥ 电泳检测１． 蛋白 Ｍａｒｋｅｒ ； ２． 纯化后的蛋白； ３． 上清液；４． 总蛋白； ５． 未诱导对照Ｆｉｇ．４ ＳＤＳ － ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ ； ２．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ； ３．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ；４．Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ； ５．Ｃｏｎｔｒｏｌ２．３ ＰＮＥ４５的酶活鉴定由图５可知，在含 Ｍｇ２＋ 的缓冲溶液中，ＰＮＥ４５可切刻超螺旋的 ｐＵＣ１９质粒解旋变为切刻环状，并且随着ＰＮＥ４５质量浓度的增加开始出现了少量线性质粒，表明 ＰＮＥ４５ 蛋白具有切刻核酸内切酶活性。由图６可知，在含 Ｍｎ２＋ 的缓冲溶液中，ＰＮＥ４５还可以将质粒进一步降解为小片段，表现出对位切刻的活性。本研究同时检测了 ＰＮＥ４５对 Ｈｏｌｌｉｄａｙｊｕｎｃｔｉｏｎ和单碱基错配底物的切割活性，结果表明，ＰＮＥ４５ 不能识别切割上述 ２ 种底物。图 ５ ＰＮＥ４５ 在Ｍｇ２＋ 缓冲液中的酶活检测Ｍ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ； １～９．分别为２．５ ， １．２５ ， ０．６２５ ， ０．３１３ ， ０．１５６ ， ０．０７８ ， ０．０３９ ， ０．０２０ ， ０．０１０ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５切刻结果；ＮＭ 、 ＬＭ 、 ＳＭ．分别为切刻环状、线性、超螺旋质粒条带Ｆｉｇ．５ Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｈｅｃｋｉｎｇ ｉｎ Ｍｇ２＋ｂｕｆｆｅｒＭ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ； １－９．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｓ ２．５ ， １．２５ ， ０．６２５ ， ０．３１３ ， ０．１５６ ， ０．０７８ ， ０．０３９ ， ０．０２０ ， ０．０１０ μ ｇ ／ ｍＬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ；ＮＭ ， ＬＭ ， ＳＭ．Ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｉｃｋｅｄ ， ｌｉｎｅａｒ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｂａｎｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ３ 讨 论本试验成功地克隆并表达纯化了大肠杆菌噬菌体 ｐｈｉｖ１０ 基因 ４５ 编码的蛋白 ＰＮＥ４５ ，催化特性分析结果显示，其是一种新的随机切刻 ＮＥａｓｅｓ 。在Ｍｇ２＋ 存在条件下，该酶具有 ＤＮＡ 随机切刻活性，而在 Ｍｎ２＋ 存在条件下，其又具有切刻位点对位切刻活性。与此前发现的２类切刻核酸酶不同的是：ＰＮＥ４５对 ＤＮＡ 的切刻具有随机性，而此前发现的２类切刻核酸酶对 ＤＮＡ的切刻具有序列特异性 ［２ ］ ；ＰＮＥ４５与已发现的２类切刻核酸酶序列相似度很低，分别属于不同的蛋白家族。
ＰＮＥ４５属于一个功９ ９ １第１２期 梁亚峰，等：切刻核酸内切酶ＰＮＥ４５的原核表达与活性鉴定
能未知的 ＤＵＦ１０６４蛋白家族，该家族成员具有ＰＤ －（ Ｄ ／ Ｅ ）
ＸＫ特征基序，该基序也出现在许多限制性内切酶和重组修复酶中。
ＰＮＥ４５是 ＤＵＦ１０４６蛋白家族中第１个被证实的核酸酶，该核酸酶的进一步研究对 ＤＵＦ１０４６蛋白家族和ＰＤ － （ Ｄ ／ Ｅ ）
ＸＫ超家族的功能和进化研究具有重要的意义。 切刻内切酶的应用还处于初级阶段，但已有一些成功的实例，如 Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ已被应用于 ＮＥＢ ＵＳ －ＥＲ＊ 克隆试剂盒，用于引入长的非互补性黏性末端 ［１２ ］ 。
ＮＥａｓｅｓ还被用于恒温 ＤＮＡ 扩增技术，用于引入位点特异性切刻，并利用该切刻位点在 ＤＮＡ聚合酶的催化下实现靶序列的扩增 ［１３ ］ ，如 Ｎｔ．Ｂｓｔ－ＮＢＩ和 Ｖｅｎｔ （ ｅｘｏ － ）
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ合用的恒温扩增技术 ［１４ ］ ，与 Ｎｔ．ＣｖｉＰⅡ 和Ｂｓｔ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅⅠ合用的恒温扩增技术 ［１５ ］ 。本研究开发的 ＰＮＥ４５是一种具有潜力的工具酶，其切刻核酸酶活性在新的基因组测序技术和人工重组（ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ）技术的 ＤＮＡ前处理中具有潜在的应用价值 ［１６ ］ 。图 ６ ＰＮＥ４５ 在Ｍｇ２＋ 和Ｍｎ２＋ 缓冲液中的酶活性比较Ｍ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ； １～５． 为 Ｍｇ２＋ 缓冲液中 ＰＮＥ４５ 的酶活性；７～１１． 为 Ｍｎ２＋ 缓冲液中 ＰＮＥ４５ 的酶活性；６ ， １２． 为对照； １ ， ７．１．２５ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ 切刻结果； ２ ， ８．０．６２５ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ 切刻结果； ３ ， ９．０．３１３ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ 切刻结果；４ ， １０．０．１５６ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ 切刻结果； ５ ， １１．０．０７８ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ 切刻结果； ＮＭ 、 ＬＭ 、 ＳＭ． 分别为切刻环状、线性、超螺旋质粒条带Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＰＮＥ４５ｉｎ Ｍｇ２＋ ａｎｄ Ｍｎ ２＋ｂｕｆｆｅｒＭ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ； １－５．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＮＥ４５ｉｎ Ｍｇ２＋ ｂｕｆｆｅｒ ；７－１１．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＮＥ４５ｉｎ Ｍｎ２＋ ｂｕｆｆｅｒ ；６ ， １２．Ｃｏｎｔｒｏｌ ；１ ， ７．１．２５ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ ； ２ ， ８．０．６２５ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ ； ３ ， ９．０．３１３ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ ； ４ ， １０．０．１５６ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ ；５ ， １１．０．０７８ μ ｇ ／ ｍＬ ＰＮＥ４５ ； ＮＭ ， ＬＭ ， ＳＭ．Ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｉｃｋｅｄ ， ｌｉｎｅａｒ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｂａｎｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ［参考文献］［ １ ］ Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ Ｊ ， Ｂｅｌｆｏｒｔ Ｍ ， Ｂｅｓｔｏｒ Ｔ ， ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅ －ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ， ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ， ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅ －ａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｓ ［ Ｊ ］ ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ， ２００３ ， ３１ ：
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Ｈ７ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｐｈｉＶ１０ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ －ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈａｇｅ － ｅｎｃｏｄｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｔｈｅＯ１５７ａｎｔｉｇｅｎ ［ Ｊ ］ ．Ｆｅｍｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ， ２００９ ， ２９２ （ ２ ）：１８２ － １８６．［ ７ ］ Ｋｏｓｉｎｓｋｉ Ｊ ， Ｆｅｄｅｒ Ｍ ， Ｂｕｊｎｉｃｋｉ Ｊ Ｍ．Ｔｈｅ ＰＤ － （ Ｄ ／ Ｅ ）
ＸＫ ｓｕｐｅｒ －ｆａｍｉｌｙ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ ：
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第３９卷
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研究对象：
基因组DNA、 质粒DNA、总RNA、 mRNA等过程：裂解：
破碎细胞， 使细胞中裂解：
破碎细胞， 使细胞中的核酸游离在裂解体系中核酸提取纯化：
使核酸与裂解体系中的其它成分， 如蛋白质、 盐及其它杂质彻底分离
• 核酸提取的主要步骤：破碎细胞破碎细胞I.材料准备II.破碎细胞或包膜——内 容物释放提取提取纯化纯化III.核酸分离、 纯化IV.沉淀或吸附核酸， 并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。鉴定：
浓度、 纯度、 完整性鉴定技术：
分光光度技术、 凝胶电泳技术
第一节 预处理一、 样品预处理1、 组织组织有新鲜组织、 甲醛固定或石蜡包埋组织。新鲜组织先用生理盐水洗， 然后将其捣碎或剪碎，加液氮研磨成粉状， 加细胞裂解液裂解细胞；甲醛固定组织要先去掉甲醛；石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。
2、 培养细胞培养细胞需弃细胞培养液， 用缓冲液进行多次漂洗， 方可用于提取核酸。
3、 血液血液可以是新鲜血液或者冻贮血液；注意抗凝剂的选择， 一般用EDTA-Na2或枸橼酸钠， 不可使用肝素；全血离心弃血清（或血浆）
、全血离心弃血清（或血浆）
、加适量的红细加适量的红细胞裂解液（破膜液）
， 裂解红细胞， 再加适量的细胞核裂液（破核液）
， 裂解白细胞中的细胞核， 使核内DNA 释放出来。
二、 提取用具预处理（一）
DNA提取用具的处理试剂、 器材高压干燥等进行无DNA酶处理。试剂、 器材高压干燥等进行无DNA酶处理。（二）
RNA提取用具的处理
1、 提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备• 塑料制品：
使用灭菌的一次性用品。
或用0. 1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意: 有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀, 故不能使用氯仿处理) 。玻璃用品• 玻璃用品：使用前于180℃的高温下干烤6h以上使用前于180℃的高温下干烤6h以上， 或或在220℃下干烤3h以上。• 有机玻璃的电泳槽等, 可先用去污剂洗涤, 双蒸水冲洗,乙醇干燥, 再用3％H2O2室温浸泡10min， 然后用0. 1％DEPC水冲洗， 晾干。
• 所需溶液的配制：
必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液， 用干烤过的药匙称取试剂， 把溶液装入无RNase的玻璃器皿。• 严格来说， 所有溶液均应用0. 1％DEPC于37℃处严格来说， 所有溶液均应用于处理12小时以上， 然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟， 去除残余DEPC。
• 在涉及RNA的一切操作过程中， 都应戴一次性手套和口罩， 应勤换手套。2． RNA提取中RNase污染的控制
第二节DNA的提取一、 DNA的常规提取真核生物DNA主要以核蛋白形式(DNP) 存在于细胞核中中， 因此要从细胞中提取DNA时， 必须先粉碎组织，因此要从细胞中提取DNA时必须先粉碎组织裂解细胞膜和核膜， 使核蛋白释放， 再把蛋白质除去， 再除去细胞中的糖类， 脂类、 RNA等物质， 沉淀DNA,
去除盐类， 有机剂等杂质,
得到纯化的DNA。
1、 酚-氯仿提取法
2、 浓盐法• 核糖蛋白（RNP）
与脱氧核糖蛋白（DNP）
在不同浓度的NaCl溶液中溶解度显著不同。
DNP 在0. 14mol/L NaCl溶液中溶解度最小， 仅为水中的1％的1％。当当NaCl浓度增至1mol/L时， DNP的溶解l浓度增至1l/ 时的溶解度比在水中大2倍。
利用这一性质可将DNP从破碎后的细胞匀浆中分离出来， 也可以使DNP和RNP分离，DNP的蛋白部分可用苯酚、 SDS等其他方法将其除去。
3、 玻璃棒缠绕法• 用盐酸胍裂解细胞， 然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上， 用一个代沟的或前端为U型的玻璃棒在这两层溶液的交界面慢慢搅动沉淀出的胶状DNA缠绕在玻面慢慢搅动， 沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。
玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并与室温下蒸发乙醇， 由胶状逐渐回缩，然后浸入TE缓冲液中， 使其重新吸水膨胀而和玻璃棒分离。
4、 玻璃颗粒吸附法• 首先利用含异硫氰酸胍的细胞裂解液裂解细胞，然后加入能够与DNA结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合DNA的玻璃颗粒， 利用洗脱液经沉淀收集结合DNA的玻璃颗粒， 利用洗脱液进行洗脱获得DNA。
不仅玻璃颗粒可以和DNA结合， 一定大小的硅胶颗粒也可以和DNA结合。
二、 质粒DNA的提取（1）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。（2）
小的1-3kb，大的可达数百kb。（3）
进入细菌，可自我复制或表达。
质粒DNA的提取有效方法• 方法：
碱裂解法； 氯化铯密度梯度分离法； 煮沸裂解法等。• 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：
培养细菌使质粒扩增养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒收集和裂解细菌分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA， 根据实验所需)• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：
质粒的大小、 大肠杆菌菌株、 裂解后用于纯化的技术和实验要求。
1、 培养细菌和扩增质粒用氯霉素抑制宿主细胞的蛋白质合成， 从而抑制染色体的复制和分裂而抑制染色体的复制和分裂； 质粒的复制系质粒的复制系统成分的半衰期较长， 使质粒得以扩增。
2、 收获细菌和溶菌细菌裂解三种方法：机械法（如超声波等）机械法如超声波等化学试剂法（如SDS等）溶菌酶－化学试剂联合法（最常用）
3、 提取质粒主要使染色体DNA与质粒DNA分离分离主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多， 而且染色体DNA被断裂成线状分子， 但质粒DNA为共价闭环结构， 当加热或用酸、 碱处理DNA溶液时， 线状染色体DNA容易发生变性， 共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时， 蛋白质与DNA发生变性， 当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性， 呈溶解状态， 离心时留在上清中；能够迅速复性， 呈溶解状态， 离心时留在上清中；（1 ）
碱裂解法蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状， 离心时可沉淀下来
（2）
氯化铯密度梯度分离法• EB分子可嵌入碱基对之间， 使DNA解旋• 开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋， 可结合大量EB， DNA-EB复合物含EB越多 ， 密度越小。闭环质粒DNA没有游离末端• 闭环质粒DNA没有游离末端， 不易解旋， 结合少量EB， 密度较大。不易解旋结合少量• 在饱和EB条件下， 质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大， 经氯化铯密度梯度离心， 可分离提取质粒DNA 。
（3）
煮沸裂解法• 通过加热， 使细菌裂解、 蛋白质和染色体DNA变性。• 降低温度， 闭环质粒DNA复性留于上清液， 染色体DNA不能复性与变性蛋白质形成沉淀， 可通过离心不能复性与变性蛋白质形成沉淀， 可通过离心出去而分离。
第三节 RNA的提取一、 总RNA的提取所有RNA的提取过程中都有五个关键点， 即：①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶的活性。
常用的RNA酶抑制剂①焦碳酸二乙酯（DEPC）
：
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。②异硫氰酸胍：
目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂。③氧钒核糖核苷复合物④RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)
⑤其他：
SDS、 尿素、 硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
RNA的提取方法1、 异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性， 再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底RNA沉淀于管底， 而DNA与蛋白质在上清液中。而DNA与蛋白质在上清液中使使用这种方法， 不但能得到高质量的RNA， 而且能同时分离出细胞染色体DNA。
本法已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。
2、 盐酸胍-有机溶剂法• 盐酸胍变性蛋白质， 抑制RNA酶， 有机溶剂抽提去除蛋白质， 通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA。
此法适用于没有超速离心设施的情况下提取细胞总RNA， 提取的RNA质量较好， 但整个操作过程繁杂费时。
3、 氯化锂-尿素法• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，氯化锂选择性沉淀RNA。• 其缺点是有时会存在DNA污染， 氯化锂沉淀RNA会丢失丢失一些小分子RNA， 如5sRNA等。
优点是快速、些小分子如等优点是快速简便、 产量高， 尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取。
4、 一步快速热酚抽提法• 将异硫氰酸胍、 巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠（SLS）
等联合使用， 抑制RNA的降解， 裂解细胞， 增强对核蛋白复合物的解离， 使RNA与蛋白质分离然后用苯酚白质分离； 然后用苯酚、 氯仿等抽提去除蛋白质和DNA， 乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。便快速， 可在3小时以内处理大批样品， 对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。氯仿等抽提去除蛋白质此法操作简
二、 mRNA的提取从提取的总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）
-柱层析法分离：
mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）
结合， 其他成在高盐浓度条件下与Oligo（dT）
结合， 其他成分被洗掉， 再通过低盐浓度洗脱mRNA而分离。
第四节 核酸的鉴定一、 核酸浓度检测1、 定磷法DNA和RNA中都含有磷酸， 根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9 4%均含磷量为9. 4%， DNA的平均含磷量为9. 9%， 因此可DNA的平均含磷量为9 9%因此可从样品中测得的含磷量来计算DNA或RNA的含量。2、 定糖法RNA含核糖， DNA含有脱氧核糖， 根据这两种糖的颜色反应可对DNA和RNA进行定量测定。
3、 紫外吸收法DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值， 用标准样品测得在波长260nm处， A260＝1时， 样品中双链DNA浓度为50 μ g/ml浓度为50 μ g/ml， 单链DNA或RNA浓度为40 μ g/ml。单链DNA或RNA浓度为40 μ g/mlDNA(μ g/μ l)
= A260× 50× 稀释倍数/1000RNA（μ g/μ l ）= A260× 40× 稀释倍数 /1000
二、 核酸纯度检测•核酸的纯度用A260/A280比值表示。OD260/ OD280＝1.8——为DNA纯品OD260/ OD280＝1.8~2.0——为RNA纯品
三、 核酸完整性检测• 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳）
，溴化乙锭染色， 紫外灯观察。凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带• 凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。
完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、 18s rRNA、5s rRNA的三条带， 其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍， 5s rRNA 较弱。完整性良
基因组DNA抽提结果电泳图
总RNA抽提结果电泳图mRNA
第五节电泳根据电泳支持介质分：琼脂糖凝胶电泳：
多用于鉴定较大核酸琼糖胶泳片段（0. 1～60kb）
， 特别是分子量测定聚丙烯酰胺凝胶电泳：
用于鉴定较小的核酸片段， 特别是DNA测序
电泳的基本原理• 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子， 如蛋白质、 核酸等都具有可电离基团， 它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电， 在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下， 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、 形状等性质的差异， 使带电分子产生不同的迁移速度， 从而对样品进行分离、 鉴定或提纯的技术。
一、 琼脂糖凝胶电泳• 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、 快速、 最常用的分离、 纯化和鉴定核酸的方法。• 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种线性多糖。• 琼脂糖凝胶的制作是将适量的琼脂糖粉末悬浮于琼脂糖凝胶的制作是将适量的琼脂糖粉末悬浮于缓冲液中， 加热煮沸至溶液变为澄清， 注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。• 凝胶具有刚性的滤孔， 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度， 低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。
琼脂糖浓度(％)线型DNA分子的分离范围(kb)0. 35～600. 61～200. 70. 8～10琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围0. 90. 5～71. 20. 9～61. 50. 2～312. 00. 1～2
琼脂糖凝胶电泳装置
• DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷， 在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同， 从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA， 主要是利用分子筛效应， 迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
因而就可依据DNA分子的大小使其分离。主要是
• RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。
在非变性电泳中， 可以分离混合物中不同分子量的RNA分子， 但是无法确定分子量。
只有在变性情况下下， RNA分子完全伸展， 其泳动率才与分子量成正RNA分子完全伸展其泳动率才与分子量成正比。
电泳仪电泳槽
• 操作流程大致为：凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳→观察和拍照。
DNA片段的琼脂糖电泳
• 琼脂糖凝胶电泳有许多优点：操作简单， 电泳速度快， 分离核酸范围广， 样品不需事先处理就可以进行电泳；电泳图谱清晰，分辨率高， 重复性好；电泳后区带易染色， 样品极易洗脱， 便于定量测定。
制成干膜可长期保存。
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳• 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE， 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成， 这一聚合过程需要有自由基催化完成。
常用的催化聚合合程需要有自由基催化完成方法有两种：
化学聚合和光聚合。
化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）
以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED）
， 四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。
凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定。常用的催化聚合
聚丙烯酰胺凝胶形成过程示意图
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测核酸， 常见两种聚丙烯酰胺凝胶：
用于分离纯化双链DNA片段的非变性电泳聚丙烯酰胺凝胶和用于分离和纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。
其转载DNA样品量片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。
其转载DNA样品量也比琼脂糖凝胶大， 分辨力也高于琼脂糖凝胶电泳， 相差1bp的DNA片段也能分开， 但其操作复杂。
聚丙烯酰胺凝胶制胶装置
核酸分为两大类—核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。核酸的基本组成单位是核苷酸， 是由 众多的核苷酸缩合而成的多聚核苷酸。
核苷酸经过水解可以得到含氮碱、戊糖和磷酸。真核生物基因组 DNA 和 RNA 广泛应用 在动、植物的遗传育种基因图谱的构建、品种鉴定、物种形成和系统演化等方面的研究中， 无论是基因工程， 还是蛋白 质工程， 核酸分子都是这些技术应用所涉及的主要对象， 所以 DNA 和 RNA 的分离与提取是分子生物学研究中重要的基本技术［1］。1材料和方法1．1材料供试材料为冷冻的新鲜剪碎猪肝 4g［2］。
所用 试剂为 SC 缓冲 溶液：2．94g 柠檬酸钠 和 9．0g氯化钠溶于 1L 蒸馏水（用盐酸调 pH 值至 7．0）；5％ SDS 溶液； 地衣酚试剂：
先配制 0．1％三氯化铁的浓盐酸溶液， 实验前以此溶液为溶剂配成 0．1％地衣酚溶液； 氯化钠；95％冷乙醇； 氯仿； 异戊醇。1．2猪肝 DNA 和 RNA 的提取1．2．1DNA 的提取①取新鲜猪肝捣碎液， 装入离心管， 平衡，4 000r/min 离心 10min， 除去上层； ②下层加入 SC 溶液5mL 混匀 ， 同上离心， 除去上层；③下层沉淀转移入三角 瓶，加入 SC 溶液 20mL，SDS 溶液 3mL 混匀 ，5mL 氯仿 ／异戊醇混匀 ， 固体氯化钠 2g 边加边混， 充分振荡 30min，4 000r/min离心 20min； ④小 心取出 离心管， 观察有 3 层， 取出 上层水相； 水相加入等体积氯仿 ／异戊醇振荡 10min，4 000r/min 离心 20min；⑤取上清， 加等体积 95％冷乙醇， 边加边顺一个方向搅， 玻璃棒上缠绕的 DNA 用少量 80％乙醇洗一次， 置小离心管于 4℃冰箱中待用［3，4］。1．2．2RNA 的粗提①接上面的第一步， 在上清中加入等体积的氯仿/异戊醇置于带塞烧瓶中振荡， 冰浴 30min；②将混合物转移至 1.5mL EP 管中，4℃、12 000r/min 离心 15min，将上清液移至另 一 EP 管中； 加异丙醇， 在冰上放置 15min，3 000r/min 离心 10min， 得到 RNA 沉淀［5，6］。1．3核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色D－核糖核酸＋浓盐酸＋地衣酚———反应显绿色—反应显蓝紫色D－2－脱氧核糖核酸＋酸＋二苯胺——1．3．1 DNA 显色1mL SC 溶液溶解 DNA， 然后转移到 50mL离心管中， 用 9mL 0．01mol／L NaOH 溶液溶解，4 000r/min 离心 10min， 上清转移到试管中备用。
各取上述 1mL DNA 溶液于两只试管中， 其中一只里面加入 3mL 地衣酚试剂， 然后置沸水中 20min， 观察颜色反应； 另 外一只试管中加入 2mL 二苯胺试剂 ，60℃条件下反应 1h， 观察颜色反应。1．3．2RNA 显色将 RNA 沉淀用 2mL 蒸馏水溶解， 然后转移至 2 只试管中， 每只 1mL。
其中一只试管中加入 3mL 地衣酚试剂， 然后置沸水中 20min， 观察颜色反应； 另 外一只 试管中加入2mL 二苯胺试剂，60℃条件下反应 1h， 观察颜色反应。1．4核酸的定量和纯度测定紫外分光光度法 （此法要求核酸纯度很高，1 个吸光度值相当于 50μg／mL 双螺旋 DNA； 除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260／A280比值， 纯的 DNA 为 1．8，RNA 为2．0， 样品中含有蛋白 质和苯酚时，A260／A280比值降低。
）； 定糖法（DNA 糖部分为脱氧核糖，RNA 糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法）； 定磷法（核酸的磷酸部分）。1．4．1二苯胺显色法原理DNA 在酸性条件下其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂， 生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸， 而 2－脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω－羟基－γ－酮基戊糖， 与二苯胺试剂反应生成蓝色物质， 在 595nm收稿日 期：2009－05－20作者简介：
周之超（1989－）， 男， 湖北汉川 人， 在读本科生， （电话）13545375310（电子信箱）zzc19890415＠126．com。猪肝组织核酸的分离纯化及鉴定周之超， 石明明（武汉大学生命科学学院生物学基地班， 武汉430072）摘要：
利用盐溶法分离制备动物基因组 DNA 和 RNA 的方法， 并对实验过程进行改良和分析。实验中选用新鲜猪肝作为实验材料， 根据核糖核蛋白 与脱氧核糖核蛋白 在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离， 利用 SDS 裂解， 氯仿、异戊醇抽提， 分离得到猪肝脏中基因组 DNA 和 RNA； 同 时， 通过脱氧核糖和核糖的显色反应定性区分了DNA 和 RNA； 实验最后利用紫外分光光度法和二苯胺法定量测定了 DNA 样品中的 DNA 的含量。关键词：
核酸；DNA；RNA； 地衣酚显色法； 二苯胺显色法中图分类号：Q503；Q52文献标识码：A文章编号：1007－273X（2009）08-0007-037
2009 年第 8 期HUBEI JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY SCIENCES波长处有最大吸收（见图 1）［5］。
DNA 在 40～400μg 范围内 ， 光吸收与 DNA 的浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。1．4．2DNA 吸光度的测定①A260测定：
以 H2O 作为空白 ，取上清测 A260值后确定稀释倍数， 使 A260值在 2．0 左右（DNA此时的浓度约为 100μg／mL。
（由 于二苯胺法的测定范围是40~400μg／mL DNA， 所以 DNA 浓度如果太小会影响测定结果）。
②A280测定：A260／A280比值计算。
纯的 DNA 为 1．8，RNA为 2．0。
如果样品中混有 RNA， 则比值大于 1．8； 如果样品中混有蛋白 质， 则比值小于 1．8。所用的 DNA 溶液为前面提取后溶解的 DNA 样品。1．4．3DNA 标准曲线的制作和样品测定DNA 标准曲 线的制作加样见表 1。按表 1 加完各试剂后， 充分混匀 。
于 60℃水浴中保温1h， 冷却后于 595nm 波长处以 0 管为空白 调零， 测定各管光密度（OD595）。以 DNA 的含量为横坐标， 光密度（吸收值）为纵坐标， 绘制标准曲线。
（注：
待测溶液中的 DNA 含量应调整至标准曲线的可读范围内 。
样品 1 和样品 2 为不同稀释倍数的DNA 溶液。
）1．4．4DNA 含量计算以样品的光密度， 根据标准曲 线计算出 相对应 DNA 含量， 并同紫外法测定的值进行比较。
（注：二苯胺试剂具有腐蚀性， 且二苯胺反应产生的蓝色不易 褪色， 操作中应防止洒出 ； 比色时， 比色杯外面一定要擦干净。
）2结果与分析2．1猪肝 DNA 及 RNA 的分离提取2．1．1核酸分离的原则核酸存在于多种细胞， 因 此， 分离方法复杂多样。
因各种 DNA、RNA 含量的差异、核酸的纯度及量的要求不同， 因此， 在实验前应对所采用 的方法有所选择。
总的说来， 核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上， 利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液， 即水相）， 分离， 纯化； 利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀， 收获核酸。2．1．2DNA 和 RNA 分离的 基本原理根据核糖核蛋白 与脱氧核糖核蛋白 在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离， 然后用 蛋白 质变性沉淀剂去除蛋白 ， 使核酸释放出 来， 再利用 核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出 ， 达到分离DNA 和 RNA 的目 的。在 0．14mol／L 的氯化钠溶液中 ，RNA 核蛋白 溶解度大，而 DNA 核蛋白 溶解度小； 相反在 1mol／L 的氯化钠溶液中，DNA 核蛋白 的溶解度大， 而 RNA 核蛋白 的 溶解度小， 从而使 DNA 和 RNA 核蛋白 分开。2．1．3核酸分离的一般步骤①溶解细胞：
溶解细胞的方法（sodium dodecyl sulfate，SDS）
加包 括 十 二 烷 基 硫 酸 钠NaOH、蛋白 酶和用超声波破碎等方法。
②有机溶剂抽提：
利用 SDS 溶液提取的 目 的 是使蛋白 质变性沉淀于有机相 ， 而核酸保留在水相， 达到分离核酸的目 的。
③沉淀：
为了除去分离过程中残留的有机溶剂， 常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸， 再通过离心回收核酸， 然后用 80％乙醇洗涤沉淀， 除去多余的盐， 以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。试剂盒：
目 前开发了许多商品化的核酸分离柱， 可简单、快速地分离得到纯度很高的 DNA 或 RNA， 其分离原理有的是利用核酸的分子量差异， 有的是利用 所需分离的核酸的特点将其特异性结合达到分离、回收的目 的。
④传统的酚、氯仿、异戊醇在抽提中的作用 ：a.酚：
有效的使蛋白 质变性， 不能完全的抑制 RNA 酶的活性， 能溶解带有长 poly（A）的 RNA 分子。使用前必须用水饱和并用 Tris 平衡至 pH＞7．8， 以防止 DNA分配到有机相。
结晶酚要在 182℃下重蒸去除醌类等氧化产物， 这些物质能够引 起磷酸二酯键的断裂或促进核酸交联。b.氯仿：
纯酚的比重为 1．07， 有机相和水相有时很难分开。
加入氯仿（比重为 1．47）可以避免这一问题。
同时， 酚有时会微溶于水。
可以用氯仿将水相中的酚去除。
c.异戊醇：
减少泡沫的产生。2．2核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色实验DNA 脱氧核糖的显色反应中加地衣酚试剂的试管反应后呈茶色， 加二苯胺试剂的试管反应后呈蓝色。
反应机理是DNA 分子中 2－脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解， 产生2－脱氧核糖并形成 ω－羟基－γ 酮基戊醛， 后者与二苯胺试剂反应成蓝色化合物， 其反应为：DNA→ω－羟基－γ 酮基戊醛→蓝色复合物， 所以我们的结果与理论是一致的 ， 对于加入地衣酚的试管， 我们认为地衣酚主要是与 RNA 发生反应， 所以我们看到 的 茶色可能只 是地衣酚加 热 后 的 颜色 ， 或 者是DNA 溶液和地衣酚加热后的共同的颜色。RNA 核糖的显色实验结果表明 加地衣酚试剂的试管反应后呈浅绿色， 加二苯胺试剂的试管反应后呈黑色。
RNA 与浓盐酸共热时发生降解， 产生的核糖又可转变糖醛， 在 FeCl3或 CuCl2催化下， 糖醛与 3，5－二羟基甲 苯（地衣酚、苔黑酚）反应形成绿色复合物， 实验结果观察到为浅绿色， 符合理论结果， 颜色稍浅， 可能是浓度过低， 试液被稀释的结果， 或者是酸度不够没有加催化剂的影响。
对于加入二苯胺试剂的试管， 我们认为二苯胺试剂主要是与 DNA 发生反应， 所以我们看到的黑色可能只是二苯胺试剂加热后的颜色。2．3核酸的定量和纯度测定2．3.1DNA 标准曲 线的制作和样品测定按照表 1 的顺序加入样品 反应得到 DNA 标准曲 线样品 测 定的 结果 （ 见表2）， 以 DNA 的含量为横坐标， 光密度（吸收值）为纵坐标， 绘制标准曲线（见图 2）。2．3．2DNA 含量的 计算由 图 2 所作的 DNA 标准曲 线可知，DNA 含量与 OD595的关系为：图 1二苯胺显色法原理图表 1DNA 标准曲线的制作加样表试剂DNA 标准溶液（200mg ·mL-1）/mL蒸馏水/mL二苯胺试剂/mL0（对照）0.02.04.010.41.64.020.81.24.031.20.84.041.60.44.052.00.04.0样品12.00.04.0样品22.00.04.0管号【试验研究】8
2009 年第 8 期《湖北畜牧兽医》月 刊邮发代号 38-352HUBEI JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY SCIENCESOD595＝0．0022×c（DNA）浓度实验中样品 1 为 DNA 原液， 样品 2 为稀释 1 倍的 DNA溶液。
将 OD595值 0．274 和 0．174 分别 代入上面的 公式， 可求得样品 1、 样品 2 中的 DNA 含量分别为 124．54μg／mL 和79．09μg／mL。
由 紫外分光光 度法 得 ，1 个吸光 度值相 当 于50μg／mL 双螺旋 DNA，我们测得稀释一倍的 DNA 溶液吸光度值为 1．734， 所以其 DNA 含量为 50μg／mL×1．734＝86．7μg／mL，则原液 DNA 含量为 86．7μg／mL×2＝172．4μg／mL。由实验结果得知， 通过 DNA 标准曲 线测得的 DNA 含量比紫外分光光度法测得的值要低， 由于而在我们的实验过程中很难保证这一点， 所以我们认为通过 DNA 标准曲 线测得的 DNA 含量值更为可信。
而且， 紫外分光光度法对核酸纯度要求很高， 但测得的 A260／A280比值为 1．727， 纯的 DNA 为1．8， 说明 样品 中混入了 蛋白 质， 可能是在 DNA 的 分离纯化中， 没有将蛋白 质除尽的缘故。3讨论（1）
在细胞内 的 核酸通常是与蛋白 质形成复合物而存—核糖核蛋白 和脱氧核糖核蛋白 。
核蛋白 在水溶液和各在——种电解质溶液中有一定的溶解度， 所以在前面研磨步骤将损失一部分核酸。
因此应避免加入大量的水进行研磨， 以减少核蛋白的溶解。（2）
核酸酶降解核酸所带来的 误差。
脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的存在导致了一些核酸降解成为了 核苷酸， 在水中溶解后被弃去。
防止该误差的主要方法有两种， 一是选取核酸酶含量较低的材料， 如小牛胸腺细胞等； 二是降低酶活性， 保证操作在低温下进行， 以此来抑制酶的活性。（3）在碱性溶液中溶解 RNA 后加 HCl 时， 溶液呈酸性，有小部分 DNA 此时也被水解掉了 。
可以之前利用氯仿－异戊醇法或苯酚法去除蛋白 质， 然后在溶解 RNA 后就可以直接把上清液分离出 来。地衣酚法测 RNA 反应原理是：
当 RNA 与浓盐酸共热时．即发生降解．形成的核糖继而转变成糠醛， 后者与 3，5－二羟基甲 苯（地衣酚 orcinol）反应， 在 Fe2＋或 Cu2＋催化下， 成鲜绿色复合物， 反应产物在 670nm 处有最大吸收。
所以， 地衣酚法特异性差， 凡戊糖均有此反应， 己糖持续加热产生的羟甲基糠醛， 以及 DNA 和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。
另 外，RNA 浓度在 10~100μg／mL 范围内 ， 光吸收与RNA 浓度成正比， 其中所用 标准液浓度为 100μg／mL， 笔者认为采用 50μg／mL，RNA 待测液浓度再稀释一倍， 所测结果再利用线性关系计算会更准确些［4］。（4）提取基因组 DNA 要保证其一级结构的完整性， 排除其他生物大分子（蛋白 质、多糖、脂类等）以及 RNA 分子的污染， 并且不存在过高浓度的有机溶剂和金属离子， 以避免化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏和对后续的酶反应产生抑制作用； 同时， 应尽量简化操作步骤， 以减少提取过程中有害因 素对核酸的 破坏。
该试验使用 SDS 破坏细胞膜、核膜， 使蛋白 质变性， 有效去除核酸分子结合的蛋白 质， 从而游离出 核酸， 它主要用来抑制核酸酶的活性， 避免 DNA 被降解； 加入氯仿也是为了 使核蛋白 变性， 促使 DNA 分子释放，有效抑制核酸酶活性， 去除带有 poly（A）长链的 RNA。
该试验所用试剂均为常见的化学试剂， 不需要昂 贵的生物试剂；试验仪器要求低， 操作简单， 完成一...
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 第 47 卷 第 第 23 期 2016 年 年 12 月
·4289· 核酸等温扩增技术及其在中药分子鉴定中的应用研究概况 吴文如1 ，杨
璐 1 ，周
华 2
1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州
510006 2. 中药质量研究国家重点实验室，澳门科技大学，澳门
000853 摘
要：中药品种的准确鉴定是中药质量控制的首要环节，寻找高效、便捷、准确的鉴定方法，是中药鉴定技术的发展趋势。相对于以表型标记为鉴定特征的传统方法，DNA 分子遗传标记鉴定技术具有更加准确、可靠的特点，适用于近缘混淆及多来源品种的鉴定，但同时受 PCR 技术的限制，存在成本高、步骤复杂、时间长的缺点，无法实现快速鉴定。环介导等温扩增是一种新型核酸扩增技术，具有高特异性、高灵敏性、简便、快速、低成本等优点，成为继 PCR 技术之后的又一新兴技术，可成功实现对中药材的快速分子鉴定。通过对常见的核酸等温扩增技术及其在中药材分子鉴定研究中的应用情况进行综述，为中药材的快速分子鉴定体系研究提供参考。
关键词：环介导等温扩增；核酸等温扩增技术；中药鉴定；分子鉴定；快速鉴定 中图分类号：R282.1
文献标志码：A
文章编号：0253 - 2670(2016)23 - 4289 - 07 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.23.028 Isothermal nucleic acid amplification technology and its application in molecular identification of Chinese materia medica WU Wen-ru 1 , YANG Lu 1 , ZHOU Hua 2
1. School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Macau 000853, China Abstract: Accurate identification of varieties is the most important part of quality control of Chinese materia medica (CMM). To find an efficient, convenient, and accurate identification method is the development trend of identification technology of CMM. Compared with the traditional identification method based on phenotypic markers, DNA molecular marker technology is more accurate and reliable, suitable for the identification of closely related species and sample with confusion and multiple sources, but unable to realize the rapid identification due to the limits of the PCR technology, such as high cost, complex procedures, and the drawback of long time. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel nucleic acid amplification technology, with the advantages of high specificity, high sensitivity, simple, rapid, low cost, etc., become another new technology after PCR to realize the rapid molecular identification of CMM successfully. In this paper, the common isothermal amplification of nucleic acid technology and its application in the study of molecular identification of Chinese herbal medicines were reviewed analysis, to provide a reference for the study of rapid molecular identification system of Chinese herbal medicines. Key words: loop-mediated isothermal amplification; isothermal nucleic acid amplification technology; identification of Chinese materia medica; molecular identification; rapid identification
中药材的品种真伪和质量优劣，直接关系到治疗效果。因此，保证中药品种的准确鉴定是中药质量控制的首要环节。相对于传统表型标记方法，中药 DNA 分子标记鉴定技术是指通过直接分析遗传物质的多态性来对外在性状表现规律进行鉴别，DNA 分子作为遗传信息的载体，信息量大，在同种内具有高度的遗传稳定性，且不易受外界环境因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响，因此具有
收稿日期：2016-07-11 基金项目：澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室开放课题（MUST-SKL-2016-07）；广州中医药大学留学人员科技活动资助计划（薪火计划）（XH20140109）
作者简介：吴文如（1976—），男，博士，副教授，硕士生导师，从事中药分子鉴定研究，Tel: (020)39358296
E-mail: wuwenru@gzucm.edu.cn
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 第 47 卷 第 第 23 期 2016 年 年 12 月
·4290· 高度特异性。DNA 分子标记方法的兴起和逐步成熟，使得中药材以组织解剖学、化学等客观指针为依托的现代质量评价方法得到了有益的补充，并以此为突破口来解决品种鉴定中的一些难题。国内外已经利用不同 DNA 分子标记技术对几百种中药材进行了鉴别研究。《中国药典》也于 2010 年版正式将其纳入法定中药鉴定方法 [1] 。中药鉴定的发展趋势是寻找高效、便捷、准确的鉴定方法，但目前一般的 DNA 分子标记鉴别方法受 PCR 扩增技术限制，不仅存在需大量昂贵的实验仪器的缺点，而且操作检测步骤复杂，时间还是长于其他常规鉴别方法，大大限制了其作为快速鉴定方法的使用和推广。
以环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术为代表的核酸等温扩增技术的问世，解决了核酸分子标记鉴别方法上的诸多难题，使其进行快速鉴定成为可能。LAMP 是一种快速的核酸扩增技术，利用特异引物及链置换DNA 聚合酶在恒温条件下自循环几十分钟，就可完成核酸扩增反应。LAMP 法操作十分简单，对仪器设备要求低，结果的检测也很简便快捷，十分适合基层快速鉴别。与传统 PCR 技术相比，核酸等温扩增具有快速高效，且不需要专用的仪器等优点 [2] 。LAMP 方法因其具有高特异性、高灵敏性、简便、快速、低成本等特点，已在病原体检测和疾病的快速基因诊断等诸多领域应用，取得了可喜的成就。有学者利用 LAMP 技术成功进行了人参 Panax ginseng C. A. Mey.、何首乌 Polygonum multijiorum Thunb.、冬虫夏草 Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.以及蒲公英Taraxacum formosanum Kitamura等中药材的快速分子鉴定。综合来看，LAMP 法具有的简便、快速、灵敏等特点，可以实现对中药材的快速鉴定，在中药鉴定中有着广阔的应用前景。鉴于此，本文对常见的核酸等温扩增技术及其在中药材分子鉴定研究中的应用进展进行综述及分析，为中药材的快速分子鉴定体系研究提供参考。
1
常见的核酸等温扩增技术 基因扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段，人们已经建成了多种方法，其中 PCR 技术得到了广泛的应用，但该方法需要特殊的仪器、模板的热变性及长时间的温度循环，不利于在基层实验室推广。20 世纪 90 年代以来，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术得到了迅猛的发展，与PCR 技术相比，核酸等温扩增技术的特点是可在特定温度条件下实现核酸的扩增。由于扩增反应的全过程在同一温度下进行，可以通过加热模块、水浴锅等简单的，甚至非专业的设备完成反应，大大缩短了反应时间，因而能满足现代分子检测技术“快速简便”的需求，具有较大的实际应用价值 [3] 。目前，常见的核酸等温扩增技术有如下 6 种。
1.1
依赖核酸序列扩增 （nucleic acid sequence based amplification ，NASBA ）技术 NASBA是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术，又称自主序列复制系统或再生长序列复制技术 [4] ，特别适用于 RNA 分子的检测。利用 T7RNA聚合酶仅在结合核酸上相应位点才能起作用的特点，将结合位点序列与靶序列相连，然后产生靶分子的 RNA 拷贝，形成反转录和 RNA 转录的连续循环，从而使靶序列扩增。NASBA 技术已成功应用于病毒、细菌、寄生虫和细胞因子等的检测，并已被列为我国禽流感检测的国家标准 [5] 。然而针对以干燥药材和饮片为主要存在形式，RNA 已经完全降解的中药样品，该技术显然并不适用。
1.2
滚环扩增 （rolling circle amplification ，RCA）
）技术 RCA是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式而设计的一种等温核酸扩增方法，在恒温的条件下，当有环形 DNA 模板和聚合酶时，基于连接酶连接、引物延伸、与链置换扩增反应，可以产生大量的与环型探针互补的重复序列 [6] 。这种方法不仅可以直接扩增 DNA 和 RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到1个拷贝的核酸分子，因此在全基因组扩增、单核苷酸多态性、DNA 芯片、蛋白质芯片等检测方面中具很大的应用价值。然而目前 RCA 的检测也还存在诸多不足：模板 DNA 需事先环化、锁式探针合成的费用较高、易产生背景信号干扰、RCA 的结果目前没有理想的质控指标以及反应时间偏长（一般 4 h 以上）。因此，要想发展成为普通实验室的诊断技术，还应在探针设计和实验室质控等方面做进一步的探索研究 [7] 。
1.3
单引物等温扩增 （single primer isothermal amplification ，SPIA ）技术 SPIA 主要是通过一条 3’端是 DNA 片段、5’端是 RNA 片段的混合引物，RNase H 及具有强链置换活性的 DNA 聚合酶实现 DNA 的体外线性等温扩增。SPIA 扩增反应一般在 55～65 ℃进行，全程需要 30 min，反应过程中，RNase H 不断降解引物与
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·4291· 模板DNA所产生的DNA/RNA杂合链中的RNA部分，使未结合的引物能够不断获得结合位点并与模板进行链置换合成，并在模板链末端或链终止序列结合处终止，最终扩增出大量的具有高度忠实性的cDNA 单链 [8] 。该技术在 RNA 扩增方面具有较大优点，然而其引物合成相对复杂，反应需要碱基修饰，且无法进行实时定量分析，因此目前仍难以应用在中药材分子鉴定研究方面。
1.4
依赖于解旋酶的等温扩增 （helicase-dependent isothermal DNA amplification ，HDA ）技术 HDA 仿真自然界生物体内 DNA 复制的自然过程，在恒温条件下利用解旋酶解开 DNA 双链，同时 DNA 单链结合蛋白稳定解开的单链，为引物提供结合的模板，然后由 DNA 聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又解成单链，并作为下一轮合成的模板进入上述的循环扩增反应，最终实现靶序列的指数式增长 [9] 。
1.5
链置换扩增 （strand displacement amplification， ，SDA ）技术 SDA 是一种基于酶促反应的 DNA 体外等温扩增技术 [10] 。在靶 DNA 两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链 DNA 打开缺口，DNA 聚合酶继之延伸缺口 3’端并替换下一条 DNA 链。被替换下来的 DNA 单链可与引物结合并被 DNA 聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。目前该技术无法用于长片段扩增，一般不超过 200 bp，产物不均一，电泳法检测时出现拖尾现象，引物设计复杂，限制条件较多，使用范围比较窄 [11] 。
除了以上列举的技术以外，近年来还发展了一些其他的核酸等温扩增技术，如快速等温检测放大（rapid isothermal detection and amplification，RIDA）技 术 、 切 刻 内 切 酶 核 酸 恒 温 扩 增 （ nicking endonuclease mediated amplification，NEMA）技术、重组酶介导扩增（recombinase-aid amplification，RAA）技术 [8] 等。综合来看，这些方法或者基于DNA/RNA 生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的核酸酶，均能将微量标本进行快速扩增，但都在特异性、简便程度、温度、试剂和仪器要求等方面各有缺点。
1.6
LAMP 技术 Notomi 等 [12] 于 2000 年开发了一种新颖的核酸等温扩增方法 LAMP，其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 条特异引物，利用一种链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件（65 ℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。
引物设计是否合理是决定 LAMP 技术是否高效特异的关键。该技术针对靶基因 6 个特异区域（3’端的 F3c、F2c、Flc 区以及 5’端的 B1c、B2c、B3c区）设计 4 条特异引物，即上游外引物（F3）、下游外引物（B3）、上游内引物（FIP）、下游内引物（BIP）。FIP 引物在 3’末端含有与 F2c 互补的 F2 区段，在 5’末端含有与 F1c 相同序列的区段。BIP 引物在 3’末端含有与 B2c 互补的 B2 区段，在 5’末端含有与 B1c相同序列的区段（图 1，引自 Eiken Co. Ltd. 网站）。为提高扩增效率，可以再添加 2 条环状引物，即上游环状引物（LF）和下游环状引物（LB）。
F3-上游外引物
B3-下游外引物
FIP-上游内引物（F2＋F1c）BIP-下游内引物（B2＋B1c）
F3-forward outer primer
B3-backward outer primer
FIP-forward inner primer
BIP-backward inner primer 图 1
LAMP 引物在靶基因上的设计 Fig. 1
Design of LAMP primers on target gene LAMP的扩增原理是利用Bst DNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力，在恒温条件下短时间（30～60 min）内完成靶 DNA 的高效扩增，整个反应分为两大阶段，即初反应物哑铃状模板的合成，基因循环扩增、延伸和再循环阶段（图 2，引自 Eiken Co. Ltd. 网站）。
第 1 阶段：哑铃状模板构造形成。在具有链置换活性 DNA 聚合酶的作用下，内引物 FIP 与模板DNA 结合形成互补链；随后，新合成链在外引物F3 的作用下被置换，而被置换的单链在 5’末端形成环...
紫外分光光度法（ 此法要求核酸纯度很高， 1个Abs相当 于50ug/ml双螺旋DNA, 除了 定量测定以外还可进行核酸纯度的检测， A260/A280比值， 纯的DNA为1. 8， RNA为2. 0， 样品中含有蛋白质和苯酚时，A260/A280比值降低。
） 定糖法（ DNA糖部分为脱氧核糖， RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（ 核酸的磷酸部分）DNA测定的方法原理
二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下加热， 其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂， 生成嘌呤碱、 脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸， 而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω -羟基-γ -酮基戊糖， 与二苯胺试剂反应生成蓝色物质， 在595nm波长处有最大吸收。
DNA在40~400μ g范围内， 光吸收与DNA的浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
实验内 容
DNA标准曲线的制作和样品测定试剂管号0对照12345样品1样品2DNA标准溶液,ml0.00.40.81.21.62.02.02.0蒸馏水， ml2.01.61.20.80.4000二苯胺试剂,ml4.04.04.04.04.04.04.04.0OD595注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内 。样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。按上表加完各试剂后， 充分混匀。
于60℃水浴中保温1h， 冷却后于595nm波长处以0管为空白调零， 测定各管光密度（ OD595nm）
。
以DNA的含量为横坐标， 光密度（ 吸收值）
为纵坐标， 绘制标准曲线。
DNA含量计算
堕型坚！Ｑ 塑， ！吐箜：
盟垒２液相核酸芯片鉴定角膜常见致病真菌的初步实验研究董燕玲谢立信银红梅孙士营黄海南【摘要】目的探讨建立快速鉴定角膜常见致病真菌的液相核酸芯片检测系统及其应用于真菌性角膜炎临床快速诊断的可行性。
方法实验研究。
设计针对５种角膜常见致病真菌（ 茄病镰刀菌、 串珠镰刀菌、 尖孢镰刀菌、 烟曲霉菌及黄曲霉菌）ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因内转录间隔（ ＩＴ Ｓ ）区的种特异性探针，５７ 端氨基Ｃ １２修饰后与不同荧光色的微球结合， 建立液相核酸芯片检测系统。
将目的真菌的５株标准菌株和４ ２株角膜分离保存菌株的基因组Ｄ Ｎ Ａ 以一对真菌通用引物扩增并标记后用于杂交检测。实验中设立单一菌种检测与多菌种混合检测的比较， 以及芯片检测与琼脂糖凝胶电泳检测的比较， 采用配对设计资料的ｔ检验和Ｓ ｐ ｅａ ｒｍ ａ ｎ 等级相关分析对榆测结果进行统计学分析， 进而评估该检测系统的特异性、 灵敏度和重复性。
结果所建立的液相核酸芯片体系可在聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ ）后３ｈ内准确将５株标准菌株鉴定至菌种的水平； ４ ２株角膜分离保存菌株单次检测阳性率达９ ５． ２％； 阳性信号与背景比值位于５． ６ —１３． ３之间； 单一菌种检测和５种菌种平行检测的中位荧光强度（ Ｍ Ｆ Ｉ）差异无统计学意义（ ｔ＝ ０ ． ２５２４ ， Ｐ ＝ ０ ． ８ １３２）； Ｍ Ｆ Ｉ的变化与Ｐ Ｃ Ｒ 产物的量呈正相关（ ‘＝ １． ０ ０ ０ ０ ， Ｐ ＜０ ． ０ １）； 最低检测浓度为０ ． ９ ４ ｎ ｇＰ Ｃ Ｒ 产物， 比琼脂糖凝胶电泳低４ ０ 倍； ４ 次重复检测的变异系数在１． ８ ％～１３． ７ ％之间。
结论所建立的液相芯片检测系统具有较高的特异性、 灵敏度及重复性， 可同时完成对５种角膜常见致病真菌的菌种检测， 为液相芯片技术在临床真菌快速诊断中的应用奠定了实验基础。
ｆ 中华聪搴≯杂志， ２００９， ４５：
１１０—１１４）【关键词】
寡核苷酸序列分析； 角膜； 真菌Ｐ ｒ ｅ ｌｉｍ ｉｎ ａ ｒ ｙｓｔｕ ｄ ｙｏ ｎ ｔｈ ｅ ｕ ∞ｏ ｆ Ｄ Ｎ Ａｓｍ ｐ ｅ ｍ ｉｏ ｎａ ｒ ｒ ａ ｙｆ ｏ ｒ ｔｈ ｅ ｉｄ ｅ ｎ ｔｉｆ ｉｃ ａ ｔｉｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｏ ｒ ｎ ｅ ａ ｌｐ ａ ｔｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉｃＤ Ｏ Ｎ ＧＹ ａ ｈ —ｌｉｎ ｇ ’ ， Ｘ ＩＥ Ｌ ｉ—ｘ ｉｎ ． Ｙ ＩＮＨ ｏ ｎ ｇ － ｍ ｅ ｉ， ｓＵ ＮＳ ｈ ｉ－ ｙ ｉｎ ｇ ， Ｈ Ｕ Ａ Ｎ ＧＨ ａ ｉ—ｒｌ皿ｒｋ ‘Ｔ ｋ Ｓ ｔａ ｔｅＫ ｅ ｙｆ ｕ ｎ ｇ ｉＬ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔｏ ｒ ｙＣ ｕ ｌｔｉｖ ａ ｔｉｏ ｎＢ ａ ｓｅ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇＰ ｒ ｏ ｖ ｉｎ ｃ ｍ ｌＫ ｅｙＬ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔｏ ｒ ｙｏ ｆ Ｏ ｐ ｈ ｔｈ ａ ｌｍ ｏ ｌｏ ｇ ｙ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇＥ ｙ ｅＩｎ ｓｔｉｔｕ ｔｅ，Ｑ ｉｎ ｇ ｄ ａ ｏ２ ６ ６ ０ ７ １， Ｃ ｈ ｉｎ ａＣ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓｐ ｏ ｎ ｄ ｉｎ ｇａｕｔｈｏｒ：
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１０． ３７ ６０／ｃｒｒｍ ． ｊ． ｉｓｓｎ ． ０４１２－ ４０８１． ２００９． ０２． ００４基金项目：
国家自然科学基金资助项目（ ３０ ６ ３０ ０ ６ ３， ３０ ２７ １３９ ４ ）； 山东省科技攻关计划项目（ ２０ ０ ４ Ｇ Ｇ ２２０ ２１５４ ）作者单位：
２６ ６ ０ ７ １青岛， 山东省眼科研究所山东省眼科学重点实验窀一省部共建国家重点实验室培育基地（ 董燕玲、 谢立信、 银红梅、 孙士营）； 山东省医药生物技术研究中心（ 黄海南）通信作者：
谢立信。
Ｅ ｍ ａ ｉｌ：
ｌｉｘ ｉｎ ｘ ｉｅ＠ ｐ ｕ ｂｌｉｃ， ｑ ｄ ． ｓｄ ． ｃｎ・论著．万方数据
生堡堕拄盘查！Ｑ 塑生！旦筮箜鲞箍！翅ｇ 丛！』 Ｑ Ｐ 丛坐型：
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＝ １． ００００． Ｐ ＜ ０． ０１）． Ｃ ｏ ｅｆ ｉ！ｉｃｉｅｎ ｔｖ ａ ｒ ｉａ ｔｉｏ ｎ ｏ ｆ ｆ ｏ ｕ ｒｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔｅ ｄ ｄ ｅ ｔｅ ｃ ｔｉｏ ｎ ｓ Ｗ ａ ｓ １． ８％・１３． ７ ％．Ｃ ｏ ｎ ｃ ｌｕ ｓｉｏ ｎ Ｔ ｈ ｅｓｕ ｓｐ ｅ ｎ ｓｉｏ ｎ ａ ｒ ｒ ａ ｙｉｓ ａｒ ａ ｐ ｉｄ ． ｓｅ ｎ ｓｉｔｉｖ ｅａ ｎ ｄ ｓｐ ｅ ｃｉｆ ｉｃｍ ｅ ｔｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｔｈ ｅｉｄ ｅ ｎ ｔｉｆ ｉｃａ ｔｉｏ ｎｏ ｆ ｔｈ ｅｍ ｏ ｓｔｉｍ ｐ ｏ ｒ ｔａ ｎ ｔ ｓｐ ｅ ｃ ｉｅ ｓｏ ｆｃｏ ｌＴ ｌｅａ ｌ ｐ ａ ｔｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉｃ ｆ ｕ ｎ ｓｉ ａ ｎ ｄｍ ｉｓｈ ｔ ｂｅ ｕ ｓｅｄ ｉｎ ｔｈ ｅ ｃｌｉｎ ｉｃａ ｌ ｌａ ｂｏ ｒａ ｔｏ ｒｉｅｓ． （ ｃｈ ｉｎ ＪＯ ｐ ｈ ｔｈ ａ ｌｍ ｏ ｌ， ２０ ０ ９ ． ４ ５：
１１０ ． １１４ ）【Ｋ ｅｙ ｗ ｏ ｒｄ ｓ】
Ｏ ｌｉｇ ｏ ｎ ｕ ｃｌｅｏ ｔｉｄ ｅ ａ ｒ ｒ ａ ｙｓｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅａ ｎ ａ ｌｙ ｓｉｓ； Ｃ ｏ ｒ ｎ ｅ ａ ； Ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ真菌性角膜炎是一种严重的致盲性眼病， 好发于以农业经济为主的发展中国家。
近年统计数据显示真菌性角膜炎在我国感染性角膜病中所占比例已高达３４． ８％一６１． ９％Ｄ － ２Ｊ， 所以， 真菌性角膜炎的早期诊断对防盲治盲意义重大。
但是， 临床现有诊断方法中除了耗时过长的真菌培养外都不能鉴定菌种， 难以有效地指导临床早期选择敏感药物或根据不同种属在角膜中的不同生长方式选择合适的手术方式， 因此寻找一种高效快速的真菌鉴定方法已是临床早期诊断的客观需要。液相芯片（ ｓｕ ｓｐ ｅｎ ｓｉｏ ｎ ａ ｒ ｒ ａ ｙ ）技术的出现和发展为真菌的基因诊断提供了崭新的技术平台。
它以不同荧光色的微球为载体， 交联不同检测目的的蛋白或核酸探针后可在液相中迅速与标记的对应待测物结合， 最后通过双通道激光系统同时完成定性和定量的检测。
液相芯片技术以微球为载体的液， 液反应方式解除了固． 液杂交芯片重复性差的技术障碍，具有灵敏、 特异、 通量高等优点， 目前已广泛应用于微生物检测等方面的研究。
本实验从临床真菌性角膜炎的诊断需要出发， 选取占角膜致病真菌约８０％…的茄病镰刀菌、 串珠镰刀菌、 尖孢镰刀菌、 烟曲霉菌及黄曲霉菌为目的真菌， 建立并优化真菌的液相核酸芯片诊断系统， 并对其检测特异性、 灵敏度及重复性进行评估， 初步探讨其临床应用的可行性。材料和方法一、 材料１． 真菌菌株：
本实验所用真菌标准菌株购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（ Ｃ ｈ ｉｎ ａ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌＭ ｉｃ ｒ ｏ ｂ ｉｏ ｌｏ ｇ ｉｃ ａ ｌ Ｃ ｕ ｌｔｕ ｒ ｅ Ｃ ｏ ｌｌｅ ｃ ｔｉｏ ｎＣ ｅｎ ｔｅｒ ， Ｃ Ｇ Ｍ Ｃ Ｃ ），包括茄病镰刀菌（ 编号３． １８ ２９ ）、 串珠镰刀菌（ 编号３． ４ ７ ２１）、 尖孢镰刀菌（ 编号３． ４ ７ ４ ３）、 烟曲霉菌（ 编号３． ７ ７ ２）及黄曲霉菌（ 编号０ ２７ ７ ２）各１株。
所用角膜分离保存菌株４ ２株均为山东省眼科研究所病原生物学实验室保存的角膜分离真菌， 包括茄病镰刀菌１７ 株， 串珠镰刀菌９ 株， 尖孢镰刀菌４ 株， 烟曲霉菌４ 株及黄曲霉菌８ 株。２． 主要仪器：
基因扩增仪（ 德国Ｅ ｐ ｐ ｅｎ ｄ ｏ ｒｆ 公司）、 电泳仪（ 美国Ｂ ｉｏ —Ｒ Ａ Ｄ 公司）、 紫外分光光度计（ 德国Ｅ ｐ ｐ ｅｎ ｄ ｏ ｒｆ 公司）、 Ｃ ｈ ｅｍ ｉ Ｘ Ｔ ｌ６ 凝胶成像系统（ 英国Ｓ ｙ ｎ ｇ ｅｎ ｅ公司）、 Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅｘ ｌ０ ０ 检测仪（ 美国Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅｘ 公司）。３． 主要试剂：
真菌Ｄ Ｎ Ａ 提取试剂盒（ 美国Ｏ ｍ ｅ ｇ ａ Ｂ ｉｏ —ｔｅｋ 公司）； 聚合酶链反应（ ｐ ｏ ｌｙ ｍ ｅｒａ ｓｅｃ ｈ ａ ｉｎｒ ｅ ａ ｃ ｔｉｏ ｎ ， Ｐ Ｃ Ｒ ）产物测序及引物合成（ 博尚生物技术有限公司）； ２× Ｔ ａ ｑ Ｐ Ｃ ＲＭ ａ ｓｔｅ ｒ Ｍ ｉｘ 及Ｐ Ｃ Ｒ产物纯化试剂盒（ 天根生化科技有限公司）； 探针合成（ 日本Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ 公司）； 羧基化微球（ 美国Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅ ｘ公司）； 液相芯片检测相关试剂（ 美国Ｓ ｉｇ ｍ ａ 公司）。二、 真菌基因组Ｄ Ｎ Ａ 的提取及其Ｐ Ｃ Ｒ 扩增分别将５株标准菌株和４ ２株角膜分离保存菌株复苏， 接种于沙氏培养基， ３７ ℃温箱培养５ ｄ ， 刮取培养基表面的真菌菌丝冰浴研磨， 取１０ ０ ｇ 磨碎的真菌组织置于离心管中， 按试剂盒说明步骤以离心柱法提取真菌基因组Ｄ Ｎ Ａ 。Ｐ Ｃ Ｒ 扩增体系：
总反应体积５０ 山， 包括２× Ｔ ａ ｑＰ Ｃ Ｒ Ｍ ａ ｓｔｅ ｒ Ｍ ｉｘ２ ５山， ｌ对真菌通用引物各２ 出（ １０Ｉｘ ｍ ｏ ｌ／Ｌ ）， 模板Ｄ Ｎ Ａ５ｎ ｇ ， 加灭菌去离子水补至５０ 山。
扩增条件：
９ ４ ℃５ ｒ ａ ｉｎ ； ９ ４ ℃３０ Ｓ ， ５３ｏ Ｃ ３０Ｓ ，７ ２ ℃ １ｍ ｉｎ ， ３５个循环； ７ ２℃１０ ｍ ｉｎ 。
所用扩增引物采用文献报道＂４ １的真菌通用引物：
Ｐ ， ． Ｔ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ ＧＴ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ ； Ｐ ２一Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｔ ｒ Ａ Ｔ ｒ Ｇ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ 。
反向引物Ｐ ２的５’ 端以生物素标记。
每份Ｐ Ｃ Ｒ 产物均以琼脂糖凝胶电泳初步检测扩增效果。
其中５株标准菌株的Ｐ Ｃ Ｒ 产物纯化后送交测序。三、 探针设计与合成从Ｇ ｅ ｎ ｅ ｂ ａ ｎ ｋ 获取５种目的真菌的基因序列， 将所查序列与Ｐ Ｃ Ｒ 产物测序序列以Ｃ ｌｕ ｓｔａ ｌ软件进行比对， 得到碱基对齐图， 根据上述结果应用Ｏ ｌｉ９ ０ ６． ６５和Ｐ ｒｉｍ ｅｒｐ ｒ ｅ ｍ ｉｅ ｒ ５． ０ 软件在真菌ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因内转录间隔（ ｉｎ ｔｅｍ ａ ｌ ｔｒ ａ ｎ ｓｃ ｒ ｉｂ ｅ ｄｓｐ ａ ｃｅｒ， ＩＴ Ｓ ）区序列中设计针对５种目的真菌的种特异性探针， 在保守区序列中设计５种真菌通用的阳性质控探针， 以无关探针作为阴性质控探针， 通过Ｃ ｌｕ ｓｔａ ｌ和Ｂ ｌａ ｓｔ万方数据
生堡璺整盘麦！Ｑ 塑生！旦筮箜鲞笙！翅￡ 堑！』 亚ｊ虫坐墅！：
曼尘璺！翌！Ｑ 塑， ！些箜ｔ塑垒２比对对所设计的探针进行筛选。
所设计探针在合成过程中５’ 端以氨基Ｃ １２修饰， 以备与羧基化微球交联。
探针序列如下：
茄病镰刀菌一Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ａ ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＣ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｃ ； 串珠镰刀菌． Ｔ Ｃ Ｇ 盯Ａ Ｃ Ｔ Ｇ 叽～Ａ Ｔ Ｃ Ｇ ＴＣ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ ； 尖孢镰刀菌． Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｙ ｒ Ｇ Ｇ Ｔ ＧＴ ； 烟曲霉菌一Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ｃ 哪Ａ ； 黄曲霉菌一７ ｒ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ ； 阳性质控一Ｇ Ｃ ＡＴ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ａ ； 阴性质控一Ｔ Ｉｑ ＇Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ ＡＴ ｒ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｉ？Ａ Ｃ Ｔ ｌ７ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ Ｃ 。四、 探针与微球的交联及样本的杂交检测按照美国Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅ ｘ 公司提供的液相核酸芯片操作说明分别将各种色号的微球与相应的探针进行共价交联， 并将交联后的微球等比混匀后用于与样本的杂交及Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅｘ ｌ０ ０ 分析仪检测。
实验中设立阳、阴性对照， 并以双蒸水代替Ｐ Ｃ Ｒ 反应中的Ｄ Ｎ Ａ 模板来获得背景荧光强度（ ｂ ａ ｃ ｋ ｇ ｒ ｏ ｕ ｎ ｄｆ ｌｕ ｏ ｒ ｅ ｓｃ ｅ ｎ ｃ ｅｉｎ ｔｅｎ ｓｉｔｙ ， Ｂ Ｆ Ｉ）。
分析各反应各色号微球的中位荧光强度（ ｍ ｅｄ ｉａ ｎｆ ｌｕ ｏ ｒ ｅ ｓｃ ｅ ｎ ｃ ｅｉｎ ｔｅｎ ｓｉｔｙ ， Ｍ Ｆ Ｉ）、 背景荧光强度以及信号／背景比值（ ｓｉｇ ｎ ａ ｌ． ｔｏ —ｂａ ｃｋ ｇ ｒｏ ｕ ｎ ｄ ，Ｓ ／Ｂ ）， 并以Ｓ ／Ｂ 值≥２为阳性标准” １对反应结果进行分析。
实验中所有荧光强度的数值均以校正荧光单位（ ａ ｄ ｊｕ ｓｔｅｄｆ ｌｕ ｏ ｒ ｅ ｓｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｕ ｎ ｉｔｓ， Ａ Ｆ Ｕ ）为单位进行计算。另外， 实验过程中设立单一菌种检测与多菌种混合检测的比较来评估液相芯片体系的平行检测能力； 设立琼脂糖凝胶电泳对照组来评估所建立芯片检测体系的灵敏度水平。五、 统计学分析方法采用Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ ｌ１． ５统计软件进行统计学分析。
以均值± 标准差（ 孟± ｓ）表示各组荧光强度值， 单一菌种芯片检测和多菌种平行检测的Ｍ Ｆ Ｉ比较使用配对设计资料的ｔ检验， Ｐ Ｃ Ｒ 产物浓度与相应Ｍ Ｆ Ｉ值的相关性采用Ｓ ｐ ｅ ａ ｒ ｍ ａ ｎ 等级相关分析。
以Ｐ ＜０． ０５作为差异有统计学意义。结果一、 Ｐ Ｃ Ｒ 结果５株标准菌株和４ ２株角膜分离保存菌株基因组Ｄ Ｎ Ａ 的Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳均可见清晰、 单一的电泳条带， Ｄ Ｎ Ａ 片段大小位于５０ ０ —６ ０ ０ｂ ｐ 之间（ 图１）。
将标准菌株扩增产物纯化后测序， 可见测序所得序列与Ｇ ｅｎ ｅｂ ａ ｎ ｋ 上对应菌种的ｒ Ｒ Ｎ Ａ 序列相符合， 说明扩增所得序列片段包含探针互补序列， 符合待测Ｐ Ｃ Ｒ 产物的要求。二、 液相芯片检测结果１． 标准菌株检测结果：
在优化的反应条件下， 所建立的液相芯片检测系统可以准确地将５种目的真菌标准菌株鉴定至种的水平， 无论是只检测单一菌种还是在同一个反应体系中平行检测５种目的菌种， 都可获得稳定的阳性Ｍ Ｆ Ｉ， 且两者Ｍ Ｆ Ｉ之间的差异无统计学意义（ ｔ＝ Ｏ ． ２５２４ ， Ｐ ＝ ０ ． ８ １３２）（ 图２）； 反应过程中未发现明显的非特异性杂交。１：
茄病镰刀菌， ２：
串珠镰刀菌， ３：
尖孢镰刀菌， ４ ：
烟曲霉菌， ５：
黄曲霉菌， ６ ：
Ｄ Ｎ Ａ 相对分子质量标记图Ｉ标准菌株Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果官詈叟茄病■刀茸串珠镰刀菌尖孢镰刀菌烟曲霉菌黄曲霉菌真菌菌种图２单一菌种检测与混合菌种检测的结果比较２． 角膜分离保存菌株检测结果：
角膜分离保存菌株的芯片检测结果见表１。
以Ｓ ／Ｂ 值＞ ｔ２为阳性标准， ４ ２株角膜分离菌株中４ ０ 株可与相应的检测探针发生特异性杂交， Ｓ ／Ｂ 值位于５． ６—１３． ３之间，未见明显非特异性杂交， 单次检测阳性率达到９ ５． ２％。
另外， １株茄病镰刀菌和１株烟曲霉菌初次检测时， 因Ｂ Ｆ Ｉ过高而使Ｓ ／Ｂ 值＜ ２（ 分别为１． ７和１． ９ ）， 经调整反应条件重复测定后Ｂ Ｆ Ｉ得到控制， 可获得稳定的阳性结果。
表ｌ中的Ｍ Ｆ Ｉ、 Ｂ Ｆ Ｉ及表１角膜分离培养真菌菌株的芯片检测结果伽｛萎瑚珊瑚珊瑚∞ｏ万方数据
生堡堕叠盘查！Ｑ 堕生兰旦筮箜鲞箍！翅曼塾垫』 Ｑ 吐！遒望！！：
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呈Ｓ ／Ｂ 值均以重复检测后的平均数值计算。三、 液相芯片检测灵敏度结果及与琼脂糖凝胶电泳的比较以Ｍ Ｆ Ｉ居中的尖孢镰刀菌为例， 评估所建立芯片系统的检测灵敏度。
将尖孢镰刀菌标准菌株的扩增产物分别稀释１、 ｌＯ 、 ２０ 、 １０ ０ 、 ２０ ０ 及１０ ０ ０ 倍， 各取３“ｌ用于检测， 重复实验后取均值。
结果可见，０ ． ９ ４ ～１８ ８ｎ ｇ Ｐ Ｃ Ｒ 产物均可检测出阳性结果， Ｍ Ｆ Ｉ随待测Ｐ Ｃ Ｒ 产物浓度的降低而降低， 两者呈正相关（ ｒ， ＝ １． ００００， Ｐ ＜ ０． ０１）， ０． １８８ ｎ ｇ 时ｓ／Ｂ 值＜ ２， 不能正确鉴定出所测菌种。将尖孢镰刀菌标准菌株的Ｐ Ｃ Ｒ 产物分别稀释ｌ、 ２、 ５、 １０、 ２０、 １００、 ２００及１０００倍， 各取３一以双蒸水补足体积后用于琼脂糖凝胶电泳。
结果可见，３７ ． ６ —１８ ８ ． ０ｎ ｇ Ｐ Ｃ Ｒ 产物可见单一的５５０ｂ ｐ 左右的电泳条带， 清晰度依次降低， １８． ８ ｎ ｇ 以下未见可辨认的电泳条带。
与所建立的液相芯片检测系统相比， Ｐ Ｃ Ｒ 联合琼脂糖凝胶电泳检测的最低浓度至少需是后者的４ ０ 倍。四、 液相芯片检测重复性结果以同一批次的混合微球同时对５种标准菌株重复进行４ 次平行检测， 结果见表２。
所建立的液相芯片检测体系表现出良好的重复性， 变异系数（ ｃｏ ｅｆ ｆ ｉｃｉｅｎ ｔｏ ｆｖ ａ ｒ ｉａ ｔｉｏ ｎ ， Ｃ Ｖ ）在１． ８ ％～１３． ７ ％之间。
阳性质控为６２３７ ． ０ —６５１８ ． ０ ， ６３４ ６． ９ ４ － １２６ ． ７ ，Ｃ Ｖ 为２． Ｏ ％； 阴性质控为７ ０ ． ０ —９ ４ ． ０ ， ７ ８ ． １ ４ － １０ ． ７ ，Ｃ Ｖ 为１３． ７ ％。表２同一批次５种真菌同时进行４ 次检测的Ｍ Ｆ ｌ分析讨论液相芯片技术是近年开发出的新一代分子诊断技术平台。
根据检测水平的不同， 液相芯片又可分为液相蛋白芯片和液相核酸芯片， 液相蛋白芯片以相应的抗原或单克隆抗体作为探针， 特异性相对较强， 但是临床常见角膜致病真菌少有商品化的特异性单克隆抗体， 使其在真菌的鉴定方面应用受限， 所以目前相关研究多倾向于用液相核酸芯片技术来完成真菌鉴定。一、 种特异性探针的设计液相核酸芯片应用的前提是具备针对目的真菌的高特异性的捕获探针。
真菌ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因的可变区——Ｉｒｒｓ区位于高度保守的小亚基、 ５． ８ Ｓ 小亚基及大亚基之间， 对于研究真菌属内种的划分具有重要意义Ｌ ６剖。
许多研究者已经从ＩＴ Ｓ 区选择序列建立种特异性探针旧４ ’ ９ｏ 进行芯片检测。
本文所用探针也是通过对ＩＴ Ｓ２区序列进行筛选、 比对设计而成。在探针的设计过程中除了考虑探针的长度、 解链温度（ ｍ ｅｌｔｉｎ ｇ ｔｅｍ ｐ ｅｒ ａ ｔｕ ｒ ｅ， Ｔ ｍ ）、 Ｇ Ｃ 含量， 避免二聚体、 发夹结构和连续４ 个以上重复碱基外， 我们还尽量使探针互补序列靠近３’ 端、 探针与非对应序列的碱基差异达到最大程度， 并将错配区设计到探针的中央部位以防止发生非特异性杂交¨ ０ ｜。
本实验所涉及的菌种数较少， 且所选目的菌种的ＩＴ Ｓ 区之间差异较大， 所以未见明显的非特异性杂交， 仅设计单条探针即达到检测目的。
但是， 如果所需鉴别的菌种之间亲缘关系太近， 临...
核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而存在。
分离纯化核酸总的原则 : 1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸
结构和功能的基础；
减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：
避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；
避免机械剪切力以及高温煮沸；
抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
真核DNA提取的主要步骤
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都 可以用来制备基因组DNA。
温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子。
外周血白细胞DNA的提取 （NaI法）
原理
利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核， NaI 破核膜并有效解离 DNA- - 蛋白质复合物，使核酸处于易提取状态，
再以氯仿/ / 异戊醇抽提（蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生），离心后 DNA 存在于上层水相中，以 37%异丙醇沉淀及洗涤 DNA ，即获得白细胞 DNA 。用此法提取的 DNA 可用于 Southern 杂交、 PCR 的模板等。
【试剂】
】
1．6 mol/L NaI
2．氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中保存。
3．异丙醇（isopropanol）(A.R) 4．37% 异丙醇或70%乙醇 5．双蒸水(ddH 2 O) (高压灭菌) 6．TE缓冲液 (pH 8.0)
(10 mmol/L Tris-Cl、1 mmol/L EDTA) 高压灭菌。
操作步骤
1. 取新鲜抗凝血100μ l置Ep管中, 离心10000rpm×1 min。
2. 弃上清，加ddH 2 O 200μ l, 摇匀20s。
3. 加6mol/L NaI 200μ l, 缓慢倒置摇匀20s。
4. 于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μ l, 缓慢颠倒混匀两相，离心10 000rpm×10min。
5. 吸取上层水相350μ l置一新Ep管中，加纯异丙醇200μ l, 混匀。
6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
Water phase (DNA) Water phase(DNA) proteins
precipitate chloroform
/isoamyl alcohol (lipids) STEP 5
1. 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH 2 O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。
2. 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。
3. 弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。
4. 0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。
5. 室温下放置16h或65℃放置1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶解。
【 注意事项】
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。
DNA测序
基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）
DNA的鉴定 一、 紫外法测 DNA 的纯度及浓度
原理：
组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50μ g/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25μ g/ml的核酸溶液。
操作
取15μ l DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比色并记录。
定量分析：
DNA＝A260×核酸稀释倍数(3000/15)×50/1000
=10×A260(ug/ul) 纯度分析：
DNA
A260/A280=1.8
A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化；
A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤;
A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。
注：
此法不能区分 DNA 和 RNA ，不能用于核酸粗制品的测定。
核酸凝胶电泳
核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的标准方法。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
原理 DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254－365nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
【试剂与材料】
】
1．5×TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。
2．0.5×TBE缓冲液 (pH 8.3) 3．溴化乙锭(EB)：
5 mg/ml 4．1－2% 琼脂糖凝胶: 琼脂糖1－2 g加至100 ml 0.5×TBE缓冲液, 加热熔解备用。
5．6×凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中，4℃保存。
6．DNA分子量标准
【操作步骤】
】
1．琼脂糖凝胶板的制备：将1%－2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到65℃加EB至终浓度0.5μ g/ml，倒入凝胶槽，厚度约3－5mm，放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1－2mm为止。
2．加样：样品中加1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混匀，取15μ l加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。
3．电泳：电压2－10V/cm 胶, 待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。
4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的DNA区带。
【注意事项】
】
1．加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。
2．上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。
3．EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液用后应妥善净化处理。
4．电泳过程中，EB向阴极移动，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 μ g/ml EB溶液中重新染色后检测。
5．加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1－0.5μ g即可有良好的观察效果。
6．小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(＞10 V/cm)。应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。
思考题 1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样缓
冲液中）、电泳中（加在凝胶中）、电泳后
（凝胶浸泡于EB溶液中）的染色过程，各有
何有优缺点？
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